■ 鄧永平 艾瑞波 劉曉蘭 佟佳潞 辛嘉英 郭建華

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾 161006；3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150076）

類胡蘿卜素是重要的可食用色素之一，具有多種生理功效，在食品、藥品及飼料添加劑等領(lǐng)域需求量較大[1-3]。獲得類胡蘿卜素的常見途徑包括從果實(shí)或蔬菜中提取、化學(xué)合成、微生物合成。從果蔬中提取工藝復(fù)雜、成本高、受季節(jié)限制并著色能力差；化學(xué)合成色素的毒性問題越來(lái)越受人們關(guān)注，一些化學(xué)合成類胡蘿卜素，包括蝦青素，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)有害并且禁止從藥店銷售[4-5]；微生物來(lái)源的天然類胡蘿卜素具有生產(chǎn)成本低、易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的優(yōu)點(diǎn)而受到科研工作者的青睞。目前已從一些藻類、真菌和細(xì)菌代謝產(chǎn)物中獲得了類胡蘿卜素，如來(lái)自杜氏藻（Dunaliella）、雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）、三孢布拉霉（Blakeslea trispora）、粗壯脈紋孢菌（Neurospora crassa）、粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）、紅球菌屬（Rhodopila）、紅螺菌屬（Rhodospirillum）的類胡蘿卜素已見報(bào)道[6-12]。為了降低類胡蘿卜素生產(chǎn)成本，許多工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，如玉米漿、咖啡渣、麥麩、小麥秸稈和糖蜜等都被用作微生物發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素的培養(yǎng)原料[13-17]。

好食脈孢霉（Neurospora sitophila）是遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究中非常重要的模式生物，是FDA組織認(rèn)證的安全菌株之一（GRAS，Generally Recognized as Safe），生長(zhǎng)速率快[18]。前期研究發(fā)現(xiàn)，分離自北方傳統(tǒng)發(fā)酵食品的好食脈孢霉（Neurospora sitophila，CGMCC No.1836）可以利用醋糟固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素[19]，為了提高類胡蘿卜素產(chǎn)量和醋糟的利用價(jià)值，本文對(duì)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 菌種

好食脈孢霉（Neurospora sitophila），保藏號(hào)CGMCC No.1836。

1.2 試劑和儀器

醋糟，齊齊哈爾市黑龍釀造有限責(zé)任公司；麩皮；市售；鹽酸、丙酮等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。YXQ-SG46-280S壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Himac CF15RX冷凍離心機(jī)，日立(中國(guó))有限公司；PYX-DHS·350-BS-Ⅱ隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；50i正置光學(xué)顯微鏡，尼康儀器(上海)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 斜面培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）（w/v）：馬鈴薯20%、瓊脂2%、葡萄糖2%，自然pH值。將菌體接種至斜面培養(yǎng)基中，28～30℃培養(yǎng)3～5 d。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵

在250 ml三角瓶中裝入5 g醋糟，其它原料及配比根據(jù)試驗(yàn)確定。滅菌后接入好食脈孢霉孢子懸液，接種量為每克干物質(zhì)培養(yǎng)基接入1×106個(gè)孢子。

1.3.3 發(fā)酵產(chǎn)物處理

培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵產(chǎn)物置于45℃干燥至恒重。

1.3.4 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組分的研究

①氮源種類和添加量的確定

250 ml三角瓶中加入5 g醋糟，添加醋糟量1%的氮元素（氮素來(lái)源分別為玉米黃粉、麩皮、豆粕、干豆渣、硫酸銨），按照各個(gè)氮源含氮量計(jì)算加入氮源質(zhì)量，料水比1∶3，培養(yǎng)基pH值約5.5，接入1×106個(gè)孢子/g干基，28℃光照培養(yǎng)72 h后測(cè)定類胡蘿卜素含量。將上述試驗(yàn)確定的氮源的添加量調(diào)整為0%、1%、2%、3%、4%（按照氮素含量占醋糟比重算），其它條件不變，測(cè)定類胡蘿卜素含量。

②培養(yǎng)基料水比的確定

250 ml三角瓶中加入5 g醋糟和醋糟量2%的干豆渣，分別按照料水比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5向培養(yǎng)基中加入蒸餾水，培養(yǎng)基pH值約5.5，接入1×106個(gè)孢子/g干基，在28℃光照培養(yǎng)72 h后測(cè)定類胡蘿卜素含量。

③誘導(dǎo)物及其添加量的確定

250 ml三角瓶中加入5 g醋糟，添加醋糟量2%的干豆渣，再分別加入干基量0%、4%、8%、12%、16%的濃度為5%的番茄汁和5%胡蘿卜汁，調(diào)整料水比1∶3，培養(yǎng)基pH值約5.5，接入1×106個(gè)孢子/g干基，在28℃光照培養(yǎng)72 h后測(cè)定類胡蘿卜素含量。將上述試驗(yàn)確定的誘導(dǎo)物的添加量設(shè)置為醋糟量的0%、4%、8%、12%、16%、20%、24%、28%（v/w），其它條件不變，測(cè)定類胡蘿卜素含量。

1.3.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件

采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)條件，試驗(yàn)因素分別為培養(yǎng)基初始pH值（A）、培養(yǎng)時(shí)間（B）、培養(yǎng)基溫度（C），選取三個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)（見表1）。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平

1.3.6 類胡蘿卜素含量的測(cè)定

稱取1 g干燥后發(fā)酵產(chǎn)物置于50 ml小燒杯中，加入10 ml 1 mol/l的HCl，常溫振蕩1 h，取出沸水浴5 min，迅速冰浴冷卻至室溫。

將破壁處理后的孢子液轉(zhuǎn)移至離心管中，7 000 r/min，4℃的條件下離心10 min除去HCl，并用蒸餾水洗滌，在7 000 r/min，4℃的條件下離心10 min，傾倒去掉上清液，加入適量蒸餾水水洗并離心，棄去上清液。加入20 ml丙酮萃取，在7 000 r/min，4℃的條件下離心10 min，收集上清液，用丙酮重復(fù)提取，直至上清液無(wú)色。用未接菌的醋糟培養(yǎng)基作為對(duì)照，在455 nm下測(cè)吸光度。根據(jù)公式計(jì)算類胡蘿卜素質(zhì)量。

式中：B——單位質(zhì)量發(fā)酵飼料中類胡蘿卜素質(zhì)量(μg/g);

Aλmax——最大吸收波長(zhǎng)455 nm處的吸光度；

D——測(cè)定試樣的稀釋倍數(shù)；

V——提取色素有機(jī)溶劑體積（ml）；

m——干飼料質(zhì)量（g）；

0.16 ——類胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2003和正交助手軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有試驗(yàn)均重復(fù)三次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 氮源種類和添加量的確定

按照各個(gè)氮源含氮量計(jì)算加入氮源質(zhì)量，氮源添加量見表2，氮源對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響見圖1。

表2 五種氮源含氮量及添加量

圖1 氮源對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

類胡蘿卜素主要存在于好食脈孢霉孢子中，該菌在不同的氮源中生長(zhǎng)時(shí)形成孢子的時(shí)間和孢子量不同，因而類胡蘿卜素的含量也會(huì)隨之而異。由圖1可知，在干豆渣作為氮源時(shí)，好食脈孢霉產(chǎn)類胡蘿卜素的產(chǎn)量最高；麩皮做氮源時(shí)，類胡蘿卜素產(chǎn)量略低于干豆渣；玉米黃粉、豆粕、硫酸銨作為氮源時(shí)類胡蘿卜素產(chǎn)量均較低。玉米黃粉、豆粕、硫酸銨的氮含量均高于干豆渣和麩皮，從培養(yǎng)特征分析，有利于菌絲快速生長(zhǎng)，但是不利于孢子形成，因此，選擇干豆渣作為氮源，類胡蘿卜素含量為29.06 μg/g。

培養(yǎng)基中干豆渣的添加量對(duì)類胡蘿卜素的產(chǎn)量影響見圖2。

圖2 氮源濃度對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

由圖2可知，不同的干豆渣添加量對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量有不同影響，濃度過低時(shí)產(chǎn)類胡蘿卜素含量較低，濃度為2%時(shí)類胡蘿卜素含量最高，濃度再增大反而使類胡蘿卜素的產(chǎn)量降低?？赡苁且?yàn)楫?dāng)濃度低時(shí)，不足以提供菌體生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分，氮源濃度增高，更適合霉菌菌絲的生長(zhǎng)，使得菌絲生長(zhǎng)旺盛，孢子產(chǎn)量低，而導(dǎo)致類胡蘿卜素產(chǎn)量不高。因此，確定干豆渣添加量為醋糟加量的2%。

2.2 培養(yǎng)基料水比的確定

好食脈孢霉為好氧菌，對(duì)于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量要求較高。培養(yǎng)基中水分過多，不利于氧氣流通；水分太少，會(huì)導(dǎo)致某些營(yíng)養(yǎng)成分難以呈溶解態(tài)被菌體利用。水分過多或過少均會(huì)影響菌體代謝和生長(zhǎng)，從而影響類胡蘿卜素產(chǎn)量。培養(yǎng)基料水比對(duì)好食脈孢霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素的影響見圖3。

圖3 加水量對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

如圖3所示，水分對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響較大，含水量為15 ml時(shí)，類胡蘿卜素產(chǎn)量最高。隨著培養(yǎng)基含水量增加培養(yǎng)基狀態(tài)呈黏稠狀，不利于好氧菌生長(zhǎng)，使類胡蘿卜素產(chǎn)量迅速下降。因醋槽為5 g，所以確定料水比為1∶3時(shí)，類胡蘿卜素產(chǎn)量最優(yōu)。

2.3 誘導(dǎo)物的種類及濃度確定

通過添加類胡蘿卜素前體物質(zhì)如番茄紅素等誘導(dǎo)物，可以提高微生物源類胡蘿卜素的產(chǎn)量[20-21]。誘導(dǎo)物的篩選結(jié)果見圖4。

圖4 誘導(dǎo)物對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

由圖4可知，培養(yǎng)基中添加番茄汁和胡蘿卜汁均能誘導(dǎo)類胡蘿卜素產(chǎn)量的提高，其中添加16%的濃度為5%的番茄汁對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量的提高效果最好。番茄汁中含有番茄紅素及其前體物質(zhì)，有助于促進(jìn)類胡蘿卜素的合成代謝[22]。

培養(yǎng)基中添加不同濃度的番茄汁對(duì)類胡蘿卜素的產(chǎn)量影響見圖5。

圖5 番茄汁添加量對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

由圖5可知，在培養(yǎng)基中添加16%的濃度為5%番茄汁有助于提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量，使之較對(duì)照產(chǎn)量提高，繼續(xù)增加番茄汁添加量導(dǎo)致類胡蘿卜素產(chǎn)量下降，可能是某些中間產(chǎn)物過量導(dǎo)致的類胡蘿卜素合成代謝過程酶反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。

2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

對(duì)好食脈孢霉產(chǎn)類胡蘿卜素的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果見表3和表4。

表3 L9(34)試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

如表3所示，分析極差可知培養(yǎng)條件最優(yōu)組合為A2B2C3，即初始pH值5.5、培養(yǎng)溫度28℃、培養(yǎng)時(shí)間120 h。根據(jù)極差判斷影響產(chǎn)酶因素的主次順序依次為B＞A＞C，即培養(yǎng)溫度＞初始pH值＞培養(yǎng)時(shí)間。方差分析結(jié)果見表4。

由表4可以看出，培養(yǎng)溫度顯著影響類胡蘿卜素的產(chǎn)量，培養(yǎng)基的初始pH值和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)類胡蘿卜素的產(chǎn)量影響不顯著。

經(jīng)過發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證該工藝條件較穩(wěn)定。最終確定產(chǎn)酶條件為：250 ml三角瓶裝5 g醋糟，2%干豆渣（與醋糟量比），料水比1∶3，添加16%的濃度為5%番茄汁，培養(yǎng)基pH值為6.5，在28℃培養(yǎng)120 h，優(yōu)化后類胡蘿卜素的產(chǎn)量達(dá)到45.32 μg/g，較優(yōu)化前提高了約1.56倍。

3 結(jié)論

固態(tài)發(fā)酵（SSF）可以減少能耗和水消耗，減少環(huán)境污染[23-24]。本文對(duì)好食脈孢霉固態(tài)發(fā)酵醋糟生產(chǎn)類胡蘿卜素的培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定：250 ml三角瓶裝5 g醋糟，2%干豆渣（與醋糟量比），料水比1∶3，添加16%的濃度為5%番茄汁，培養(yǎng)基pH值為6.5，在28℃培養(yǎng)120 h，優(yōu)化后類胡蘿卜素的產(chǎn)量達(dá)到45.32 μg/g，較優(yōu)化前提高了約1.56倍。通過優(yōu)化提高了好食脈孢霉固態(tài)發(fā)酵醋糟生產(chǎn)類胡蘿卜素的產(chǎn)量。

醋糟是釀醋后的副產(chǎn)品，年產(chǎn)量巨大。醋糟含水量極高(約70%)，蛋白質(zhì)含量低(6%～12%)，粗纖維含量高(15%～35%)，而且pH值較低，不易降解，直接排放易造成環(huán)境污染[25]。因此，醋糟的有效利用一直是研究人員關(guān)注的問題。通過本文的研究可為醋糟的再利用提供新途徑，也為高附加值的類胡蘿卜素提供了新的廉價(jià)生產(chǎn)方式。