■張皓然 劉金松 張玲玲 楊彩梅，*

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江臨安 311300；2.浙江萬(wàn)方生物科技有限公司，浙江安吉 313307）

抗生素在畜牧業(yè)中的濫用問(wèn)題對(duì)動(dòng)物的免疫功能和食品安全都造成了威脅。因此尋找和開(kāi)發(fā)新型的、更為安全的能代替抗生素的飼料添加劑成為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。

植物精油以其天然、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)成為抗生素的替代品，植物精油具有促進(jìn)動(dòng)物采食、提高其生長(zhǎng)性能、增強(qiáng)抗氧化和機(jī)體免疫力等功能[1]。有機(jī)酸主要是針對(duì)斷奶仔豬的胃酸分泌不足而開(kāi)發(fā)的一種飼料添加劑，但現(xiàn)在經(jīng)過(guò)逐步的研究，發(fā)現(xiàn)其具有促生長(zhǎng)和抑制害菌的作用。研究表明有機(jī)酸可降低飼料pH值，抑制霉菌和病原菌生長(zhǎng)[2-3]，改善畜禽的生產(chǎn)性能，提高飼料利用率，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力[4-5]。目前對(duì)植物精油和有機(jī)酸均有一定的研究，但對(duì)于植物精油的配伍及其與有機(jī)酸復(fù)合的抑菌作用研究較少。本試驗(yàn)通過(guò)研究不同植物精油及植物精油與有機(jī)酸復(fù)配，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的抑菌效果，從而為植物精油與有機(jī)酸在動(dòng)物生產(chǎn)中的合理應(yīng)用進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物精油（肉桂醛、百里香酚、香蘭素）、有機(jī)酸（山梨酸、苯甲酸、檸檬酸）均由浙江萬(wàn)方生物科技有限公司提供，并于陰涼避光處保存。植物精油濃度為10 mg/ml，有機(jī)酸濃度為 5、10、50 mg/ml。大腸桿菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）購(gòu)自中國(guó)菌種保藏中心。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

牛津杯法測(cè)定抑菌圈直徑。以無(wú)菌操作在培養(yǎng)基表面垂直放4個(gè)已滅菌的牛津杯，依次加入樣品（植物精油與有機(jī)酸或丁酸類(lèi)物質(zhì)分別按照1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的比例復(fù)合）。加滿(mǎn)后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱24 h。每組做3個(gè)平行。牛津杯試驗(yàn)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑＞20 mm為非常敏感，15～20 mm之間為高度敏感，10～15 mm為中度敏感，＜10 mm為低度敏感。抑菌圈直徑與抗菌活性成正比。

1.3 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定方法

采用試管二倍稀釋法測(cè)定植物精油和有機(jī)酸對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的最小抑菌濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行Duncan's法多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果分析

2.1 植物精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌的抑菌效果（見(jiàn)表1、圖1）

表1 百里香酚、肉桂醛、香蘭素的抑菌直徑比較

圖1 百里香酚、肉桂醛、香蘭素的抑菌效果

表1與圖1的結(jié)果表明：植物精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌都有抑制作用，其中肉桂醛對(duì)三種菌的抑菌效果均為非常敏感。百里香酚對(duì)金黃色葡萄球菌與沙門(mén)氏菌的抑菌效果也為非常敏感。

表2的結(jié)果表明：肉桂醛和百里香酚對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值相同，均明顯低于香蘭素，對(duì)沙門(mén)氏菌肉桂醛的MIC值最低，表明抑菌作用最強(qiáng)，百里香酚對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果好于對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌效果。香蘭素的MIC值較高，表明抑菌效果較差，MIC的結(jié)果與抑菌圈結(jié)果基本一致。

表2 百里香酚、肉桂醛、香蘭素的最小抑菌濃度比較

2.2 復(fù)合植物精油的抑菌效果(見(jiàn)表3)

由表3可知，百里香酚和肉桂醛的復(fù)合比例達(dá)到1∶2和1∶3時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的抑菌能力均達(dá)到非常敏感，百里香酚和肉桂醛的復(fù)合比例為2∶1時(shí)對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最好。但百里香酚和肉桂醛復(fù)合的抑菌效果與單獨(dú)使用肉桂醛相比有一定差異（見(jiàn)表1、表3），但兩者復(fù)合可以降低肉桂醛的用量。百里香酚與肉桂醛以1∶3的比例復(fù)合時(shí)抑菌效果最強(qiáng)。

2.3 有機(jī)酸的抑菌效果（見(jiàn)表4、圖2、表5）

由表4與圖2可知，苯甲酸、山梨酸與檸檬酸對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌均有抑菌效果，其中檸檬酸在50 mg/ml的濃度下的抑菌效果最好，均達(dá)到非常敏感水平。有機(jī)酸的抑菌能力與其濃度相

關(guān)，濃度越大，抑菌效果越強(qiáng)。由表5可知，檸檬酸的MIC值最大，結(jié)合表4的結(jié)果，表明檸檬酸在高濃度下有突出的抑菌能力，但在低濃度下的抑菌能力較弱。山梨酸和苯甲酸在較低的濃度下就能產(chǎn)生抑菌作用，但在高濃度時(shí)抑菌能力弱于檸檬酸。

表3 百里香酚與肉桂醛復(fù)合的抑菌效果

表4 不同濃度山梨酸、檸檬酸、苯甲酸的抑菌效果

圖2 不同濃度山梨酸、檸檬酸、苯甲酸的抑菌效果圖

表5 山梨酸、檸檬酸、苯甲酸最小抑菌濃度比較

2.4 復(fù)合植物精油與酸化劑(檸檬酸)復(fù)合抑菌效果(見(jiàn)表6、圖3)

表6 復(fù)合植物精油（百里香酚∶肉桂醛=1∶3）與檸檬酸復(fù)合后抑菌圈直徑

圖3 復(fù)合植物精油與檸檬酸不同比例復(fù)合的抑菌效果圖

由表6和圖3可知，植物精油與檸檬酸以不同比例復(fù)合均可明顯提高對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，表明兩者有協(xié)同作用，但是對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌效果無(wú)顯著影響。

3 討論

研究表明在植物精油中，百里香酚和肉桂醛屬于抑菌活性最強(qiáng)的成分，二者均能作用于細(xì)菌細(xì)胞膜上的靶點(diǎn)。百里香酚的疏水性成分能夠直接作用于細(xì)菌細(xì)胞膜上的雙分子脂膜，使細(xì)菌細(xì)胞膜的構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄。百里香酚可以改變大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的細(xì)胞膜上的脂肪酸的結(jié)構(gòu)和比例，降低膜不飽和脂肪酸的含量，增加飽和脂肪酸的含量，從而降低了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，破壞細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)。肉桂醛的作用部位不僅僅是細(xì)胞膜，它能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，通過(guò)影響細(xì)菌細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)保守的蛋白質(zhì)，阻止細(xì)胞分裂，從而抑制了細(xì)菌的活性。王改琴等（2014）采用瓊脂平板孔洞法分別對(duì)不同來(lái)源的肉桂醛、香芹酚等植物精油及其混合物進(jìn)行體外抑菌效果篩選和評(píng)估，結(jié)果表明肉桂醛的抑菌效果最好，肉桂醛、香芹酚、丁香酚、百里香酚4種精油組成的復(fù)方產(chǎn)品對(duì)大腸桿菌等腸道有害菌有較好的抑制作用，且熱穩(wěn)定性好[6]。李文茹等（2013）研究了肉桂、山蒼子、丁香、香茅、迷迭香和大蒜精油等6種典型植物精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性。結(jié)果表明肉桂的抑菌效果最好[7]。吳克剛等通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑、最低抑菌濃度和最小殺菌濃度，研究8種植物精油對(duì)腸道致病菌和益生菌的體外抑菌活性并與5種抗生素比較，結(jié)果表明：綜合抑菌效果最好的是肉桂和牛至，其對(duì)黃曲霉抗菌效果優(yōu)于抗生素[8]。Macheboeuf等（2008）結(jié)果表明，肉桂醛是醛類(lèi)揮發(fā)油中抑菌效果最好的活性物質(zhì)[9]。賈聰慧的研究表明，當(dāng)肉桂醛和百里香酚濃度比為6∶1時(shí)，復(fù)合精油具有最強(qiáng)的抑制大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和普通變形桿菌生長(zhǎng)的作用[10]。本試驗(yàn)的中植物精油的抑菌作用結(jié)果與其它研究結(jié)果基本一致，表明肉桂醛具有最強(qiáng)的抑菌活性，本試驗(yàn)的結(jié)果還表明：百里香酚和肉桂醛的復(fù)合比例達(dá)到1∶3時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的抑菌能力具有協(xié)同作用。

有機(jī)酸作為小分子可以穿過(guò)細(xì)菌外膜的孔道進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，作用于磷酸和脂多糖，從而破壞外膜的完整性，使細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)容物外泄，達(dá)到了抑菌的效果。王麗娜等（2015）研究表明，檸檬酸表現(xiàn)出對(duì)沙門(mén)菌屬較強(qiáng)的抑菌效應(yīng)，并對(duì)抑制細(xì)菌增殖呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性[11]。裴瑞松等（2007）研究表明，肉桂醛與檸檬酸對(duì)抑菌有協(xié)同作用，且通過(guò)復(fù)配可降低肉桂醛的MIC[12]。Paulus等（2016）的體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山梨酸、苯甲酸和檸檬酸在較低濃度時(shí)對(duì)抑掉沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)是有效的，其中苯甲酸的效果最好[13]。而Friedman等（2008）研究了70多種苯甲醛和苯甲酸對(duì)大腸桿菌O157：H7、腸沙門(mén)氏菌、空腸彎曲菌和單核李斯特菌的殺菌活性，結(jié)果表明，不同種類(lèi)的苯甲酸的抑菌效果是不同的[14]。Cerisuelo等的研究結(jié)果表明，將低劑量的植物精油與丁酸鈉混合，對(duì)沙門(mén)氏菌的抑制有很好的效果[15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，植物精油復(fù)合物與檸檬酸復(fù)合的抑菌效果優(yōu)于植物精油抑菌效果，但并沒(méi)有表現(xiàn)出比檸檬酸的單獨(dú)使用更強(qiáng)的抑菌效果，可能因?yàn)楸驹囼?yàn)使用的檸檬酸濃度較高，對(duì)3種菌的抑制作用已達(dá)到非常敏感水平，所以協(xié)同作用不明顯，低濃度的檸檬酸與植物精油的協(xié)同作用還有待于進(jìn)一步研究。