霍奕安,胡秀彩,呂愛軍,孫敬鋒
(1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院,天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)試驗(yàn)室,天津300384;2.天津農(nóng)學(xué)院,創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)試驗(yàn)室,天津300384)
斑馬魚(Danio rerio)又名藍(lán)條魚、花條魚、斑馬擔(dān)尼魚等,是一種熱帶觀賞魚體長4~6 cm,胚胎透明且體外發(fā)育,易于活體觀察,生長發(fā)育快[1]。因此已經(jīng)成為生命科學(xué)中對疾病,遺傳和毒理學(xué)的理想模式生物[2]。隨著人類社會的迅速發(fā)展,工業(yè)上產(chǎn)生的各種廢棄物,如重金屬,工業(yè)污水,農(nóng)業(yè)上產(chǎn)生的農(nóng)藥、消毒液殘留等有害物質(zhì)通過雨水沖刷,或者直接向農(nóng)田施肥等途徑對土壤、魚類等產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響,并且直接威脅到人類健康。目前,國內(nèi)關(guān)于魚類急性毒性的試驗(yàn)研究,經(jīng)常以鯉、金魚作為試驗(yàn)對象,斑馬魚還未被廣泛地應(yīng)用于藥物毒理學(xué)的研究[1-2]。近幾年,斑馬魚可作為監(jiān)測藥物靶器官的有效模型,而毒死蜱對于水生生物的急性毒性研究相對較少[3-6]。我國目前農(nóng)藥年產(chǎn)量已達(dá)到80萬t,居于世界第2位[7-9]。毒死蜱是一種廣譜高效的有機(jī)磷殺蟲、殺螨劑,具有觸殺、胃毒和熏蒸作用,對魚類和水生生物毒性較高毒[10-11]。該試驗(yàn)采用農(nóng)藥毒死蜱對斑馬魚進(jìn)行急性毒性試驗(yàn),獲得了毒死蜱對斑馬魚的基礎(chǔ)毒理學(xué)數(shù)據(jù),為水產(chǎn)養(yǎng)殖和魚病防治等提供了數(shù)據(jù)參考。
斑馬魚購于天津市某花鳥市場,平均體長3.9 cm,平均體質(zhì)量0.44 g。毒死蜱(有效成分含量40%,規(guī)格300 g,乳油劑型),購自湖北仙隆化工股份有限公司。
參照呂愛軍等[12]試驗(yàn)方法進(jìn)行,采用靜水法進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。斑馬魚試驗(yàn)前在室內(nèi)馴養(yǎng)5 d以上,其自然病死率小于1%,試驗(yàn)前1 d停止投喂飼料,在試驗(yàn)期間不喂食。培養(yǎng)箱溫度為(25±2)℃,光照/黑暗為12 h/12 h。以毒死蜱配制7個(gè)不同濃度系列,并設(shè)1個(gè)空白對照,每個(gè)濃度及對照組隨機(jī)放入10尾斑馬魚。試驗(yàn)開始后連續(xù)觀察8 h,并觀察和記錄魚的中毒情況(呼吸、反應(yīng)、平衡、游動、體色變化)及96 h內(nèi)的死亡情況和開始死亡時(shí)間與死亡數(shù)目。當(dāng)出現(xiàn)魚死亡時(shí),及時(shí)撈出,以免污染水質(zhì),觀察記錄魚體表特征與內(nèi)臟表面特征。試驗(yàn)時(shí)間是96 h,96 h后如果仍有活魚,則繼續(xù)試驗(yàn)至7 d。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用的是Bliss法來計(jì)算斑馬魚的半致死濃度LC50,安全質(zhì)量濃度用公式為
病死率=死亡試驗(yàn)魚數(shù)/試驗(yàn)魚總數(shù)×100%。
毒死蜱對斑馬魚急性毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),毒死蜱質(zhì)量濃度為1.3 mg/L時(shí),5 h后有1條開始出現(xiàn)失衡,偶爾急速竄游現(xiàn)象,12 h內(nèi)試驗(yàn)魚出現(xiàn)死亡,死亡1條,鰓部有明顯出血現(xiàn)象,至24 h病死率為20%,到48 h已經(jīng)死亡70%,24~48 h是斑馬魚的集中死亡時(shí)段;毒死蜱質(zhì)量濃度達(dá)到1.4 mg/L時(shí),72 h內(nèi)斑馬魚病死率達(dá)到100%;毒死蜱質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時(shí),7 h內(nèi)試驗(yàn)魚身體出現(xiàn)明顯折彎現(xiàn)象,鰓部均有不同程度的出血,至12 h死亡6條,至48 h全部死亡。毒死蜱質(zhì)量濃度低于1.0 mg/L時(shí),1周后仍有試驗(yàn)魚存活。各組的試驗(yàn)魚7 d時(shí)的病死率相比于96 h,在質(zhì)量濃度為0.9 mg/L和質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)出現(xiàn)變化,分別病死率從50%上升至80%、60%上升至90%。當(dāng)毒死蜱質(zhì)量濃度為0.6 mg/L時(shí),未出現(xiàn)試驗(yàn)魚死亡,說明此時(shí)毒死蜱對斑馬魚的毒性作用比較小(表1)。
表1 毒死蜱對斑馬魚急性毒性作用(病死率) %
毒死蜱對斑馬魚中毒較快,反應(yīng)比較強(qiáng)烈。在低濃度梯度試驗(yàn)中,斑馬魚剛開始放入時(shí),一般都出現(xiàn)較為激烈的急速躥游現(xiàn)象,但隨后會消失,消失的時(shí)間長短與濃度有關(guān)。適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境后,魚群積極游動,偶爾會有集群現(xiàn)象,既而出現(xiàn)上浮、頂水、尾略下垂等現(xiàn)象。但是隨著中毒程度的愈來愈深,試驗(yàn)魚出現(xiàn)抽筋,時(shí)而翻肚、時(shí)而垂直于水面等失衡現(xiàn)象,或者沉于水底,并且呼吸加快加重或弓背,身體出現(xiàn)明顯折彎現(xiàn)象,漸漸地游動能力減弱甚至喪失、反應(yīng)遲鈍、沉于水底,幾乎都會出現(xiàn)腮部出血直至死亡。
在高濃度梯度試驗(yàn)中,斑馬魚在開始受藥的短短2~5 h中,出現(xiàn)強(qiáng)烈的急速竄游,嚴(yán)重失衡掙扎現(xiàn)象,甚至躍出水面。試驗(yàn)魚短時(shí)間內(nèi)鰓部出現(xiàn)明顯出血,繼而在水中打轉(zhuǎn),直至死亡,身體有很明顯的折彎現(xiàn)象。高質(zhì)量濃度組相比于低質(zhì)量濃度組從斑馬魚受試中毒到死亡的間隔時(shí)間變短,中毒現(xiàn)象也更加明顯。
經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)算毒死蜱半致死濃度和質(zhì)量安全濃度值見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明,毒死蜱的安全質(zhì)量濃度為0.209 mg/L。參照GB/T 21281—2007我國化學(xué)物質(zhì)對魚類毒性分級標(biāo)準(zhǔn)(96 h LC50≤1.0 mg/L時(shí)為急性毒性Ⅰ級,1.0 mg/L≤96 h LC50≤10.0 mg/L為急性毒性Ⅱ級,10.0 mg/L≤96 h LC50≤100.0 mg/L為急性毒性Ⅲ級)[13]。毒死蜱的96 h LC50為0.926 mg/L,由此判定毒死蜱對斑馬魚的急性毒性為Ⅰ級。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[14]中農(nóng)藥對魚類的毒性等級劃分(劇毒,96 h LC50≤0.1 mg/L;高毒,96 h LC50≤1.0 mg/L;中毒,1.0 mg/L<96 h LC50≤10.0mg/L;低毒,96 h LC50>10.0 mg/L),可判定敵敵畏對斑馬魚為高毒。
表2 斑馬魚的LC50和SC
近幾年,斑馬魚可作為監(jiān)測藥物靶器官的有效動物模型,而毒死蜱對于水生生物的急性毒性研究相對較少[3-6]。趙于丁等[15]報(bào)道10種農(nóng)藥對斑馬魚的毒性與安全評價(jià)中,涉及到毒死蜱對于斑馬魚的毒性研究,結(jié)果顯示毒死蜱對于斑馬魚的24、48、72和96 h的半致死濃度分別為0.7943、0.7332、0.6434和0.5184 mg/L,并且斑馬魚對于毒死蜱的中毒癥狀為先興奮,后游動遲緩或困難,得出的結(jié)果判定毒死蜱對斑馬魚為高毒。在該試驗(yàn)中,毒死蜱對斑馬魚的安全質(zhì)量濃度為0.209 mg/L,斑馬魚24、48、72和96 h的半致死濃度較高,這可能與斑馬魚品系、季節(jié)和氣溫等有關(guān)。斑馬魚對于毒死蜱的中毒癥狀相對一致,而且判定毒死蜱對斑馬魚均為高毒,可以為水產(chǎn)養(yǎng)殖和魚病防治提供相對有價(jià)值的參考數(shù)據(jù)。
馬軍國等[16]通過毒死蜱對于尖膀胱螺的急性毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),毒死蜱對尖膀胱螺24、48、72和96 h時(shí)的半致死濃度分別是0.577 mg/L、0.308 mg/L、0.243 mg/L和0.160 mg/L以及安全質(zhì)量濃度為0.016 mg/L,顯示毒死蜱對于螺類的毒性要大于斑馬魚。馬繼華等[17]報(bào)道毒死蜱對于南美白對蝦的急性毒性影響,結(jié)果表明對南美白對蝦24、48、72和96 h 的半致死濃度分別為 3.44 μg/L、2.08 μg/L、1.36 μg/L和0.89 μg/L以及安全質(zhì)量濃度為0.0089 μg/L,可見毒死蜱對于蝦類的毒性更加高。已有報(bào)道南美白對蝦表現(xiàn)出來的中毒癥狀有狂游和沖撞,在水中打轉(zhuǎn);或者上下直竄,急速游動。持續(xù)一段時(shí)間之后,體色開始變白變淡,逐漸喪失游泳功能,失去平衡,躺臥在水底。南美白對蝦在高濃度梯度試驗(yàn)組中的中毒反應(yīng)很迅速,在短時(shí)間內(nèi)全部個(gè)體都出現(xiàn)明顯的中毒癥狀;而在低濃度試驗(yàn)組中,則要經(jīng)過很長時(shí)間之后才有個(gè)別受試蝦出現(xiàn)異常的癥狀。這與毒死蜱對于斑馬魚的中毒現(xiàn)象非常相似,尤其體現(xiàn)在魚體色變淡,出現(xiàn)急速竄游和失衡等現(xiàn)象。
該研究結(jié)果表明,毒死蜱對斑馬魚的急性毒性為Ⅰ級,對斑馬魚的毒性等級為高毒。毒死蜱的安全質(zhì)量濃度為0.209 mg/L,因而毒死蜱對于斑馬魚的毒性較為強(qiáng)烈,不是斑馬魚的安全藥物,不建議用來作為殺滅寄生蟲漁藥,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中需要謹(jǐn)慎使用。