劉 楠,辛 華,張樂寧,聶海英

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 胸外科,吉林 長春130033)

肺癌血行轉(zhuǎn)移是一個高度選擇性的非隨機(jī)生物學(xué)過程，包括肺癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)之間一系列復(fù)雜的生物學(xué)作用，其中肺癌細(xì)胞向血管外游走是肺癌血行轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。為此，我們在體外模擬構(gòu)建了肺癌細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移中的血管外游走過程，對肺癌細(xì)胞的血管外游走途徑加以探討。

1 材料與方法

1.1實驗所用細(xì)胞

在包被有明膠的細(xì)胞培養(yǎng)皿上培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)；3種肺癌細(xì)胞分別為：LK-2、A549、RERF-LC-KJ。

1.2血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的制備

將3×104個HUVEC加入預(yù)先制備膠原凝膠層的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)1周，經(jīng)Giemsa染色，在光鏡(40×)下觀察血管內(nèi)皮單細(xì)胞層是否已完全融合生長。同時將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入到裝有正負(fù)電極的培養(yǎng)容器內(nèi)，與電阻測定儀相連，連續(xù)記錄血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻值。

1.3連續(xù)記錄肺癌細(xì)胞血管外游走過程中血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻變化

將培養(yǎng)有單層血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)皿放入裝有正負(fù)電極的培養(yǎng)容器內(nèi)，與電阻測定儀相連，記錄血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻值；然后分別將1×105個肺癌細(xì)胞(LK-2、A549、RERF-LC-KJ)加入細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，連續(xù)監(jiān)測血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻變化。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

2 結(jié)果

2.1血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的確認(rèn)

經(jīng)Giemsa染色，在光鏡(40×)下觀察到血管內(nèi)皮單細(xì)胞層已完全融合生長(圖1)。同時測定血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻值為9.68±2.05 ohm/cm2，與相關(guān)研究報道的數(shù)值基本一致[1]，可以認(rèn)為HUVEC已完全融合生長，在膠原凝膠表面制備成血管內(nèi)皮單細(xì)胞層。

圖1 完全融合生長的血管內(nèi)皮單細(xì)胞層(Giemsa染色，40×)

2.2肺癌細(xì)胞血管外游走過程中血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻變化

因為血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻可以用來說明血管的通透性[2]，為此我們連續(xù)監(jiān)測了肺癌細(xì)胞(LK-2、A549、RERF-LC-KJ)游走過程中血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻變化。結(jié)果證實在血管內(nèi)皮單細(xì)胞層表面加入肺癌細(xì)胞后，會急速出現(xiàn)血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻下降，數(shù)分鐘后下降至最底點，然后緩慢上升(圖2)。

圖2 肺癌細(xì)胞血管外游走過程中血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻變化

我們發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞LK-2、A549、RERF-LC-KJ均可以穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞游走至血管外，同時引起血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻下降；與A549、RERF-LC-KJ相比，LK-2游走過程中血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻下降幅度更大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這也證明了LK-2比A549、RERF-LC-KJ具有更強(qiáng)的穿過血管內(nèi)皮的能力(圖3)。

注：*LK-2與A549、RERF-LC-KJ相比 P<0.05(n=6)圖3 各種肺癌細(xì)胞血管外游走過程中引起的血管內(nèi)皮單細(xì)胞層電阻下降

3 討論

肺癌血行轉(zhuǎn)移是一個高度選擇性的非隨機(jī)生物學(xué)過程，包括肺癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)之間一系列復(fù)雜的生物學(xué)作用，其中肺癌細(xì)胞向血管外游走是肺癌血行轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)[3]。我們之前的研究成功在體外模擬構(gòu)建了肺癌細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移中的血管外游走狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)進(jìn)入血液循環(huán)的肺癌細(xì)胞在靶器官穿過血管內(nèi)皮的前提是肺癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性粘附，這也說明肺癌的血行轉(zhuǎn)移具有器官組織特異性；并證實了粘附后的肺癌細(xì)胞可以穿過血管內(nèi)皮游走至血管外。但肺癌細(xì)胞是如何穿過血管內(nèi)皮的目前還不清楚，我們此次研究的目的就是對肺癌細(xì)胞的血管外游走途徑加以探討。

最初有學(xué)者認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬和釋放是腫瘤細(xì)胞穿過血管內(nèi)皮的途徑；但近些年的研究越來越不支持這種觀點，有文獻(xiàn)報道急性肺損傷的狀況下腫瘤的肺部轉(zhuǎn)移病灶明顯增多，這提示肺組織損傷導(dǎo)致的肺毛細(xì)血管通透性增加可能與腫瘤的血行轉(zhuǎn)移過程關(guān)系緊密[4]。因為體外測定血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻可以用來說明血管的通透性，為此本研究連續(xù)監(jiān)測了肺癌細(xì)胞(LK-2、A549、RERF-LC-KJ)游走過程中血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻變化，結(jié)果證實在血管內(nèi)皮單細(xì)胞層表面加入肺癌細(xì)胞后，會急速出現(xiàn)血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻下降，這種現(xiàn)象證實了肺癌細(xì)胞的血管外游走過程與血管通透性增加密切相關(guān)。因為血管通透性的增加是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞收縮、細(xì)胞間隙增大導(dǎo)致，這也就恰恰說明了肺癌細(xì)胞是穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙進(jìn)行血管外游走。實驗中我們證實肺癌細(xì)胞LK-2、A549、RERF-LC-KJ均可以穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞游走至血管外，同時引起單層血管內(nèi)皮細(xì)胞的電阻下降；與A549、RERF-LC-KJ相比，LK-2游走過程中單層血管內(nèi)皮細(xì)胞層的電阻下降幅度更大，證明了LK-2比A549、RERF-LC-KJ具有更強(qiáng)的穿過血管內(nèi)皮間隙的能力。

我們的研究能夠初步揭示肺癌細(xì)胞血管外游走過程中與血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用機(jī)制，并為以后的研究打下基礎(chǔ)。