程金章，楊景樸，仲 煒，王海濤,趙 胤，陳俊俊，王宗貴*，牙韓盛

(1.吉林大學第二醫(yī)院，吉林 長春130041;2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院;3.岳陽縣人民醫(yī)院)

近年來腫瘤干細胞理論的提出給腫瘤治療帶來了曙光,該理論認為:腫瘤組織中極少數(shù)的腫瘤干細胞是腫瘤發(fā)生、 耐受和轉(zhuǎn)移的根源[1,2]。 CD133被普遍認為是腫瘤干細胞表面特異性表達蛋白,可以作為多種腫瘤干細胞的標志物[3-6]。目前在喉癌中CD133被認為是人喉癌Hep-2細胞系中腫瘤干細胞的標志物[7]。我們前期研究也證實CD133+喉癌腫瘤干細胞具有化療抵抗性[8]。因此以腫瘤干細胞為靶點的治療為腫瘤患者帶來了希望。

免疫重組毒素是利用基因工程技術(shù)將天然毒素的受體結(jié)合區(qū)基因替換成可與腫瘤細胞表面分子特異結(jié)合的抗體或細胞因子基因,制備出具有特異性靶向作用的毒素分子，是腫瘤導(dǎo)向治療研究中的熱點之一,白喉毒素(DT)由535個氨基酸殘基組成的相對分子質(zhì)量為58000 的多肽,由受體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和酶活性區(qū)3 個在空間上相互獨立的結(jié)構(gòu)域組成[9]，適于進行各種基因工程操作。本研究采用基因工程技術(shù)將CD133(scFV)與白喉毒素片段(DAB389)進行融合,通過誘導(dǎo)、表達、純化,獲得了靶向殺傷CD133陽性腫瘤干細胞的免疫毒素DAB389-Linker-CD133(scFV),為靶向殺傷腫瘤干細胞藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒及主要試劑

T-CD133(scFV) VH 、T-CD133(scFV) VL-linker、表達載體pET28 a(+)， BL21(DE3)，CHO(CD133+)工程細胞和CHO-S細胞由吉林大學第二醫(yī)院中心實驗室保存。pUC57-DAB389由南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成； NcoI (8 U/μl)、BamHI (8 U/μl)、 MunI (8 U/μl)，XhoI(8 U/μl)、T4 DNA Ligase (350 U/μl)、克隆載體pMD18T購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自Biomega公司。

1.2引物

DNA序列見表1。

表1 引物DNA序列

1.3目的基因構(gòu)建與鑒定

按照T-CD133(scFV) VH 、T-CD133(scFV) VL-linker基因序列分別設(shè)計2條特異性引物序列(P1、P2)(見表1)分別對T-CD133(scFV) VH 、T-CD133(scFV) VL-linker進行PCR擴增，酶切后以T-CD133 VH 、T-CD133(scFV) VL-linker為模板，以P1下、P2上為引物擴增CD133(scFV) ，CD133(scFV)片段經(jīng)凝膠純化后進行TA克隆得到質(zhì)粒 pMD18T-CD133(scFV)。 用引物P3(見表1)對pMD18T-CD133(scFV)進行擴增。pUC57-DAB389和pET28a(+)通過NcoI/BamHI雙酶切構(gòu)建pET28 a(+)-DAB389。

1.4重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將CD133(scFV)片段定向連接至中間載體pET28-DAB389上，構(gòu)建pET28-DAB389- CD133(scFV)重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于感受態(tài)BL21(DE3)中，構(gòu)建重組菌株，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，核苷酸測序。

1.5重組蛋白的誘導(dǎo)表達及分析

將含有pET28-DAB389-Linker-CD133(scFV)重組質(zhì)粒的菌株1∶1 000接種于4 ml濃度為50 μg/ml 卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，37℃ 培養(yǎng)過夜。次日將上述菌液1∶100轉(zhuǎn)接于20 ml含有卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600=1，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)表達，37 ℃振蕩培養(yǎng)4小時。離心收集菌體。分別取誘導(dǎo)前后的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析。

1.6重組蛋白的純化及鑒定

將重組蛋白超聲裂解后,根據(jù)Ni 柱的使用說明純化,采用透析法對蛋白進行復(fù)性，同時對表達產(chǎn)物進行Western blot 鑒定，純品蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳后,用電轉(zhuǎn)移方法將電泳膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上,進行Western blot 印跡分析。一抗為mouse-anti-His(1∶5 000)。二抗為FITC-羊抗小鼠IgG(1∶2 000)。

1.7流式細胞術(shù)檢測DAB389-linker-CD133(scFV)的靶向性

首先用CD133單克隆抗體檢測CHO(CD133+)工程細胞和CHO-S細胞的CD133表達率。然后用CHO(CD133+)工程細胞和CHO-S細胞檢測DAB389-linker-CD133(scFV)的靶向性。陰性對照組分別為單獨CHO(CD133+)細胞和CHO-S細胞，細胞加二抗對照組，細胞加一抗、二抗對照組。一抗為mouse-anti-His(1∶5 000)。二抗為FITC-羊抗小鼠IgG(1∶2 000)。收集細胞，每管5×105個，用PBS洗滌；加入免疫毒素DAB389-linker-CD133(scFV)，用PBS稀釋至終濃度范圍為10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml，測定CD133表達率。

2 結(jié)果

2.1DAB389-Linker-CD133(scFV)原核表達載體的構(gòu)建與鑒定

重組質(zhì)粒pET28-DAB389-Linker-CD133(scFV)通過NcoI/ BamHI雙酶切后通過瓊脂糖凝膠電泳進行酶切鑒定，酶切片段大小為1 891 bp,與預(yù)期相符，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，核苷酸序列分析正確，與理論值一致。

2.2目的基因的誘導(dǎo)表達及SDS-PAGE電泳分析

通過對菌種 BL21(DE3)/pET28-DAB389-Linker-CD133(scFV)進行小量誘導(dǎo)后， SDS-PAGE電泳檢測表明，構(gòu)建的重組菌株能高效地表達重組蛋白，相對分子量大小約66 KDa。而空菌對照組和未誘導(dǎo)組均未見相應(yīng)表達帶,表明該重組菌表達了DAB389-Linker-CD133(scFV)融合蛋白。見圖2。

2.3DAB389-Linker-CD133(scFV)蛋白純化及westernblot鑒定

通過對粗蛋白DAB389-Linker-CD133(scFV) 進行Ni柱的純化制備，得到精蛋白， SDS-PAGE凝膠電泳顯示蛋白分子量大小約為66 kDa， AlphaImager 1220 v5.5軟件分析純度為95%。通過Ni-NTA親和純化、透析復(fù)性、超濾濃縮的蛋白終產(chǎn)品 DAB389-Linker-CD133(scFV) 進行SDS-PAGE和Western blot實驗，證明所表達制備的蛋白與設(shè)計的一致。見圖3。

1 空菌;2 誘導(dǎo)后上清;3誘導(dǎo)前沉淀；4 誘導(dǎo)后沉淀檢驗 注：1.SDS-PAGE電泳；A Western blot

圖1DAB389-Linker-CD133(scFV)表達圖2SDS-PAGE電泳結(jié)果圖3載體的酶切鑒定純化重組蛋白復(fù)性后SDS-PAGE電泳及Westernblot檢驗

2.4流式細胞術(shù)檢測DAB389-linker-CD133(scFV)的靶向性

用CD133單克隆抗體檢測CHO(CD133+)工程細胞和CHO-S細胞的CD133表達率，CHO工程細胞CD133表達率為86.78%，CHO-S細胞的CD133表達率為13.94%。DAB389-Linker-CD133(scFV)濃度為20 μg/ml時與CHO工程細胞和CHO-S細胞的結(jié)合率分別為41.3%，和7.87%。實驗證實重組蛋白DAB389-Linker-CD133(scFV) 對CD133陽性細胞具有較強靶向性。見圖4。

3 討論

目前越來越多的證據(jù)表明腫瘤細胞具有異質(zhì)性，存在著極少量的腫瘤干細胞，與腫瘤的增殖、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和對放化療抵抗關(guān)系密切。傳統(tǒng)治療方法雖使腫瘤細胞總數(shù)量減少，腫瘤體積縮小或臨床診斷消失，但殘留下的腫瘤干細胞可以逃逸抗腫瘤藥物，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移擴散。

圖4 流式細胞儀檢測重組蛋白與CHO(CD133+)、CHO-S細胞結(jié)合活性

CD133是位于細胞膜表面具有5個跨膜區(qū)的糖蛋白，分子量為117 kD。CD133最初在造血干或祖細胞中發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮前體細胞和神經(jīng)前體細胞中經(jīng)常有表達，而在成熟的血細胞、內(nèi)皮細胞以及神經(jīng)細胞則沒有表達。CD133表達的重要特征是隨著細胞的分化而迅速下降，這也使CD133成為分離干細胞和腫瘤干細胞的特異性分子標記[10]。CD133在腦腫瘤、肝癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、喉癌等多種實體瘤干細胞研究中發(fā)揮了重要作用[3-8,11]。因此本研究瞄準腫瘤干細胞，以CD133為靶點，利用scFV 將抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過柔性軟肽連接，具有良好的靶向性，降低了免疫原性。構(gòu)建具有靶向CD133的優(yōu)良遞送藥物載體，與免疫毒素融合構(gòu)成具有多重功能的融合蛋白，以達到與腫瘤干細胞特異性結(jié)合殺傷的目的[12]。研究中最常應(yīng)用的免疫毒素有白喉毒素、假單胞桿菌外毒素、蓖麻毒素等[13,14]。 DAB389作為白喉毒素的酶活性區(qū),它通過阻止延長因子-2 在核糖體內(nèi)促進多肽鏈延長而抑制蛋白質(zhì)合成造成細胞死亡,具有極強的細胞毒性,是靶向毒素常用的毒素分子。

本研究用基因工程原理和方法，將CD133/(scFV)和DAB389通過Linker進行連接，成功構(gòu)建了免疫毒素DAB389-Linker-CD133(scFV) 的重組表達質(zhì)粒。重組表達質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達后，蛋白電泳證實有與預(yù)期分子量大小相符的蛋白產(chǎn)生，經(jīng)鑒定為目的蛋白，經(jīng)過親和層析獲得純化的免疫毒素DAB389-Linker-CD133(scFV)，透析復(fù)性后獲得具有活性的DAB389-Linker-CD133(scFV)。通過對CHO(CD133+)和CHO-S細胞的靶向性實驗，證實DAB389-Linker-CD133(scFV)對表達CD133抗原具有良好的靶向性。

DAB389-Linker-CD133(scFV)有望對CD133+腫瘤干細胞進行靶向殺傷，以提高放化療的敏感性。為進一步研究開發(fā)針對腫瘤干細胞的靶向殺傷藥物奠定了理論基礎(chǔ)。