嚴(yán)啟梅，陸其剛，沈曉波，賈亞偉，蒲 春，楊 勇

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

根霉的用途很廣，我國自古以來就用其制曲、釀酒。根霉菌具有成品質(zhì)量穩(wěn)定、用曲量少和原酒出酒率高等特點(diǎn)，其淀粉酶活力很強(qiáng)，多用作糖化菌。宋克偉等[1]從清香大曲和酒醅中分離篩選出1株高糖化酶活力根霉，經(jīng)鑒定為米根霉，將其制成麩曲，在原大曲酒工藝不變的基礎(chǔ)上添加適量的米根霉麩曲強(qiáng)化發(fā)酵，大曲與麩曲結(jié)合，兩者取長補(bǔ)短，提高了出酒率和優(yōu)質(zhì)酒率。目前釀酒生產(chǎn)上常用的根霉菌株不多，選擇優(yōu)良、高質(zhì)量的根霉菌種是關(guān)鍵，為此，從洋河酒廠大曲中篩選出3株根霉菌，從形態(tài)特征、糖化特性方面比較，將高糖化能力的根霉菌M1應(yīng)用于中試綿柔型釀酒生產(chǎn)中，從糖化醅糖化效果、窖內(nèi)發(fā)酵情況、原酒產(chǎn)質(zhì)量及基酒風(fēng)味物質(zhì)等方面進(jìn)行分析研究，為提升綿柔型白酒品質(zhì)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 樣品與試劑

樣品：大曲，來源于洋河酒廠。

試劑：孟加拉紅，葡萄糖、濃鹽酸、硫酸銅、次甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀等均購于國藥集團(tuán)；麩皮，市售。

1.1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂15 g、孟加拉紅0.033 g、氯霉素0.1 g，加入1 L蒸餾水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯，洗凈、去皮、切成小塊，加水煮爛，用4層紗布過濾，加入葡萄糖和瓊脂，加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1000 mL，115℃滅菌20 min。

麩皮固體培養(yǎng)基：麩皮100 g，加水30～50 mL，攪拌均勻后，121℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)儀器：SW-CJ-1A標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺，無錫深藍(lán)科技有限公司；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，YXQ-LS-75S11型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；控溫水浴鍋，南通華泰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；種曲機(jī)；圓盤；電子天平，AL204型，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MILLPORE超純水系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檢測方法

水分測定：烘箱干燥法。

還原糖測定：斐林試劑法。

糖化力測定：稱取相當(dāng)于5.0 g絕干曲的曲粉，放在250 mL三角瓶中，加水（90-5×水分%）mL，緩沖液10 mL，在30℃水浴中浸泡1 h，每隔15 min攪拌1次。然后用干濾紙過濾，棄去最初5 mL，接收50 mL澄清濾液，備用，得粗酶提取液后進(jìn)行糖化酶活力的測定。

糖化酶活力定義：1 g干曲在35℃、pH4.6條件下，反應(yīng)1 h，將可溶性淀粉分解為1 mg葡萄糖所需要的糖化酶量為1個(gè)酶活力單位(U/g)。

試飯?zhí)欠峙c試飯酸度的測定參照文獻(xiàn)[2]；風(fēng)味成分分析參照文獻(xiàn)[3]。

1.2.2 菌種篩選

稀釋涂布法初篩：取5 g大曲，置于已滅菌的50 mL蒸餾水中，攪拌成懸浮液，制成10-1的溶液，然后吸取1 mL于9 mL無菌水試管中振蕩混勻，依次梯度稀釋，將10-3～10-6的稀釋倍數(shù)的菌液在分離培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，30℃下培養(yǎng)2～3 d。通過菌落形態(tài)和顯微鏡觀察將不同形態(tài)的菌落挑取到PDA平板上，采用平板劃線的方法進(jìn)行純化，純化后接種于PDA斜面上進(jìn)行保存，以進(jìn)行下一步篩選。

固體培養(yǎng)：PDA斜面保存的種子等量接種到三角瓶麩皮培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)2～3 d，期間每隔24 h搖瓶1次。培養(yǎng)結(jié)束后，40℃下鼓風(fēng)烘干。

1.2.3 根霉M1在中試綿柔型釀酒中的應(yīng)用

在中試車間綿柔型4個(gè)小組20個(gè)窖池正常開展試驗(yàn)生產(chǎn)，對照組為原小曲生產(chǎn)基酒，跟蹤檢測糖化醅糖化效果、窖內(nèi)發(fā)酵情況、原酒產(chǎn)質(zhì)量等。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

從大曲中篩選分離出3株霉菌，分別命名為M1、M2、M3，具體的菌落形態(tài)特征見表1和圖1，M1為白色、雪花狀、菌絲豐滿、菌絲間布滿孢子；M2淺灰色、棉花狀、菌絲緊密成團(tuán)，肉眼觀察不到孢子；M3黑色、平鋪在培養(yǎng)基表層、菌絲較短。由圖2顯微鏡下鏡檢觀察，M1、M2、M3有假根、孢子囊梗直接從假根處生出、黑色的孢子囊，依據(jù)形態(tài)分類鑒定為根霉。

表1 3株菌落形態(tài)

2.2 3株菌糖化特性比較

分別將3株根霉進(jìn)行固體培養(yǎng)，比較麩曲糖化特性，結(jié)果見表2。

表2 3株菌曲糖化特性比較

從表2可以直觀的看出，M1麩曲的試飯?zhí)欠?、試飯酸度、糖化力最高。試飯?zhí)欠质欠从掣骨|(zhì)量的指標(biāo)之一，同等制曲條件下，試飯?zhí)欠衷礁?，說明菌株的糖化酶活力高，麩曲質(zhì)量好。M1麩曲試飯?zhí)欠譃?3.6%，M2和M3麩曲試飯?zhí)欠址謩e為0.54%、1.19%，說明M1菌曲質(zhì)量最好，試飯酒香味濃郁；M2和M3菌曲試飯可以忽略不計(jì)。M2和M3菌曲未檢測出試飯酸度，不適合用于釀酒生產(chǎn)，可能曲的酸度主要受菌株本身的產(chǎn)酸性能影響，所以將根霉M1用于中試綿柔型釀酒生產(chǎn)。

圖1 3株菌的菌落形態(tài)

圖2 3株菌的鏡檢結(jié)構(gòu)

2.3 根霉M1在中試綿柔型釀酒中的應(yīng)用

將根霉M1制成麩曲應(yīng)用于中試綿柔型釀酒生產(chǎn)，選取4個(gè)小組，20個(gè)窖池，檢測值為平均值，跟蹤檢測糖化醅糖化效果、窖內(nèi)發(fā)酵情況及原酒產(chǎn)質(zhì)量等，對照組為普通小曲。

2.3.1 糖化醅糖化效果（表3）

選取高糖化力的根霉M1可以提高淀粉的利用率，而且根霉還可以產(chǎn)生多種有機(jī)酸，對豐滿酒體有一定作用。綿柔型白酒生產(chǎn)原料主要為高粱，采用堆積糖化工藝，根霉M1具有邊生長邊糖化的作用，完成淀粉向還原糖轉(zhuǎn)變過程，可增加糖化醅的酒香味與復(fù)合香。由表3可知，試驗(yàn)組糖化醅還原糖和酸度等理化指標(biāo)較對照組好，尤其是還原糖，比對照組高15%～25%，糖化醅聞香優(yōu)于對照組，糖化穩(wěn)定性好。

2.3.2 窖內(nèi)發(fā)酵溫度變化

當(dāng)糖化醅完成糖化后入池封窖，整個(gè)發(fā)酵的產(chǎn)酒、生香過程處于完全封閉的狀態(tài)，而對窖內(nèi)溫度的實(shí)時(shí)監(jiān)測直觀地反映了酒醅發(fā)酵狀況。窖池中溫度的變化是由環(huán)境溫度（主要是地溫）和窖池微生物進(jìn)行生長代謝時(shí)共同作用的結(jié)果[4]。

由圖3可以看出，窖內(nèi)發(fā)酵溫度升溫速度正常，5 d左右達(dá)到頂溫，溫度在30～36℃之間，挺火時(shí)間6～9 d。發(fā)酵初期，酒醅中富含豐富的營養(yǎng)成分和氧氣，微生物大量繁殖，尤其以酵母、細(xì)菌為主，直至耗盡酒醅中殘存的氧氣，酵母菌、細(xì)菌迅速生長并進(jìn)入穩(wěn)定期，開始酒精發(fā)酵，酒精發(fā)酵是放熱過程，且微生物呼吸也產(chǎn)生熱量，窖池各層酒醅溫度緩慢升高直至頂火，進(jìn)入穩(wěn)定期，各種微生物相互制約、相互依存，處于一種動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)，窖內(nèi)溫度維持挺火階段。發(fā)酵后期，窖內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡、酸度和乙醇濃度的增加改變了窖內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，酵母、細(xì)菌等微生物大量死亡，產(chǎn)生的熱量隨之減少，溫度逐漸降低。圖3分析發(fā)現(xiàn)，窖內(nèi)上部、中部和下部的酒醅發(fā)酵基本遵循“前緩中挺后緩落”的規(guī)律。

表3 糖化醅糖化效果比較

圖3 窖內(nèi)發(fā)酵溫度變化

2.3.3 窖內(nèi)微生物變化規(guī)律

為了詳細(xì)的了解窖內(nèi)發(fā)酵情況，選取兩個(gè)窖池定時(shí)取樣，分析微生物變化規(guī)律，結(jié)果見圖4、圖5、圖6。

綿柔型釀酒工藝采用堆積糖化工藝，根霉菌完成高粱等淀粉原料的糖化過程，糖分含量升高，入池發(fā)酵。發(fā)酵前期，營養(yǎng)成分、氧氣充足，加之窖內(nèi)適宜的溫度條件（30～36℃之間），霉菌、細(xì)菌、酵母大量繁殖，由圖4、圖5、圖6分析可知，發(fā)酵10 d左右，霉菌數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢，到中后期又出現(xiàn)一個(gè)回升現(xiàn)象，并逐漸趨于穩(wěn)定；20 d后細(xì)菌、酵母數(shù)量急劇下降，發(fā)酵后期，窖內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡、酸度和乙醇濃度的增大改變了窖內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，霉菌、細(xì)菌、酵母等微生物大量死亡，同時(shí)，在發(fā)酵后期檢測出地霉菌，地霉菌是綿柔型酒醅發(fā)酵過程中一種常見的優(yōu)勢菌，這對發(fā)酵后期綿柔型風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要的貢獻(xiàn)作用，同時(shí)在濃香型酒醅中也檢測出地霉菌。

圖4 窖內(nèi)霉菌變化規(guī)律

圖5 窖內(nèi)細(xì)菌變化規(guī)律

圖6 窖內(nèi)酵母變化規(guī)律

2.3.4 原糧出酒率（表4）

表4中以普通小曲酒為對照組，根霉M1麩曲發(fā)酵作為試驗(yàn)組。通過統(tǒng)計(jì)20個(gè)窖池的原糧出酒率，試驗(yàn)組比對照組高3.4%，中試試驗(yàn)表明，試驗(yàn)曲M1根霉菌M1麩曲在提高綿柔型白酒出酒率上效果明顯。

表4 原糧出酒率

2.3.5 基酒風(fēng)味成分

利用根霉M1麩曲生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)綿柔型基酒風(fēng)味成分見表5。

表5 基酒風(fēng)味成分 (mg/100 mL)

經(jīng)品評根霉M1麩曲生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)綿柔型基酒比普通小曲酒在口感上更綿柔、豐滿。通過比較基酒風(fēng)味成分發(fā)現(xiàn)，白酒中的呈香、呈味物質(zhì)決定著白酒的風(fēng)格和質(zhì)量，綿柔型白酒具有“高而不烈、低而不寡、綿長而尾凈、豐滿協(xié)調(diào)”等特點(diǎn)，源于種類眾多的酸、酯、醇、醛等風(fēng)味物質(zhì)間的平衡性。酸是白酒中的重要呈味物質(zhì)，試驗(yàn)組總酸含量比對照組高7%，與其他香味物質(zhì)共同組成白酒所特有的芳香，同時(shí)有機(jī)酸能增加酒的口感，減少或消除酒中的雜味。適當(dāng)?shù)乃崾咕d柔型酒在“味”上獨(dú)樹一幟，低而不淡、柔而不寡、綿長尾凈、豐滿協(xié)調(diào)[5]。己酸乙酯是綿柔型白酒的主要香氣風(fēng)味物質(zhì)，從表5可以看出，試驗(yàn)組平均值分別比對照組高3.5%。試驗(yàn)組的乙醛、乙縮醛含量與對照組差別不大，適量的醛酮能輔佐酒的放香；高級醇含量，試驗(yàn)組與對照組差別不大，適量的高級醇能襯托酒體的酯香味，使綿柔型白酒具有醇甜感。

3 結(jié)論

3.1 通過微生物分離純化、形態(tài)結(jié)構(gòu)、糖化特性等方法，從大曲中分離出1株高糖化能力根霉菌M1，該根霉菌曲的試飯?zhí)欠譃?3.6%，糖化力為1224 U/g。

3.2 將根霉菌M1應(yīng)用于中試綿柔型釀酒生產(chǎn)中，跟蹤檢測糖化醅糖化效果，試驗(yàn)組糖化醅還原糖和酸度等理化指標(biāo)較對照組好，尤其是還原糖，比對照組提高15%～25%，糖化醅聞香復(fù)合香味優(yōu)于對照組；窖內(nèi)發(fā)酵溫度升溫速度正常，5 d左右達(dá)到頂溫，溫度在30～36℃之間，挺火時(shí)間6～9 d，窖內(nèi)上部、中部和下部酒醅發(fā)酵基本遵循“前緩中挺后緩落”的規(guī)律；入池發(fā)酵，發(fā)酵前期霉菌含量在103cfu/g以下，發(fā)酵后期20 d左右?guī)缀鯔z測不到霉菌；發(fā)酵前期，營養(yǎng)成分、氧氣充足，加之窖內(nèi)適宜的溫度條件（30～36℃之間），酵母、細(xì)菌大量繁殖，20 d后細(xì)菌、酵母數(shù)量急劇下降，檢測出地霉菌。試驗(yàn)曲M1根霉菌M1麩曲在提高綿柔型白酒出酒率上效果明顯；無論從品評還是風(fēng)味成分的分析，表明根霉M1麩曲生產(chǎn)的基酒質(zhì)量得到了提高。