金光明 樸蓮善

延邊大學(xué)附屬醫(yī)院1醫(yī)學(xué)影像二科，2內(nèi)分泌科（吉林延吉 133000）

下肢動(dòng)脈硬化（lower limb arteriosclerosise，LLAS）是2型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）最常見(jiàn)的大血管并發(fā)癥之一，據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道［1］，T2DM患者并發(fā)LLAS發(fā)生率達(dá)22%～46%，糖尿病病程5年、5～10年和10年以上者，LLAS發(fā)病率分別是22.6%、23%和66.7%［2］。臨床上一旦出現(xiàn)下肢動(dòng)脈缺血的癥狀如間歇性跛行、靜息痛、缺血性壞疽等，治療相當(dāng)困難，尤其是動(dòng)脈硬化（ar?teriosclerosise，AS）和 硬化 斑 塊（arteriosclerosise plaques，ASP）形成引起動(dòng)脈狹窄、閉塞，會(huì)導(dǎo)致下肢的缺血、缺氧，繼而引發(fā)下肢壞疽、壞死，這是T2DM患者截肢致殘，甚至死亡的主要原因，對(duì)人類健康危害極大。因此，對(duì)LLAS進(jìn)行早期診斷、早期治療尤為重要。本課題組經(jīng)過(guò)多年的研究發(fā)現(xiàn)，NADPH氧化酶p22phox亞基C242T基因多態(tài)性與T2DM患者頸動(dòng)脈硬化、糖尿病腎病及糖尿病視網(wǎng)膜病變這些大血管及微血管病變存在相關(guān)性，但對(duì)于其與LLAS的關(guān)聯(lián)仍有待于研究。延邊地區(qū)是我國(guó)最大的朝鮮族聚集地，而邊疆地區(qū)少數(shù)民族的健康問(wèn)題一直是黨和國(guó)家關(guān)心的問(wèn)題，因此在本實(shí)驗(yàn)中，探討了NADPH氧化酶p22phox亞基基因多態(tài)性在中國(guó)延邊地區(qū)朝鮮族T2DM患者中的分布情況，分析該位點(diǎn)的基因多態(tài)性與朝鮮族T2DM患者發(fā)生的關(guān)系，旨在從基因水平上對(duì)LLAS的發(fā)病進(jìn)行早期預(yù)防、早期治療，達(dá)到造福邊疆地區(qū)少數(shù)民族患者的目的。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象選取本院住院的朝鮮族T2DM患者298例，其中男170例、女128例，平均年齡（52.56±10.49）歲。T2DM診斷依據(jù)1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)彩色多普勒超聲結(jié)果共篩選出AS患者254例，其中無(wú)斑塊（ASNP）患者191例，有斑塊（ASP）患者63例。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料采集記錄受試者年齡、性別、血壓、病程、體質(zhì)指數(shù)、吸煙、飲酒與否和實(shí)驗(yàn)室檢查數(shù)據(jù)，包括空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、甘油三酯（triglyceddes，TG）、總膽固醇（total choles?terol，TC）等。計(jì)算體質(zhì)指數(shù)（BMI）=體質(zhì)量（kg）/［身高（m）］2。

1.2.2 彩色多普勒超聲檢查選擇西門子公司S 2000型多功能彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率為5～7.5 MHz。受檢者檢查前靜坐或平臥10 min以上，檢查前1 h禁止抽煙、飲酒等。選用動(dòng)脈血管條件模板，取樣容積3～5 mm，探頭置于血管縱切面中央，聲速與血流夾角＜60°。掃查股總動(dòng)脈、股淺動(dòng)脈時(shí)受檢者取仰臥位，掃查腘動(dòng)脈時(shí)取俯臥位，囑患者雙下肢伸直，稍分開(kāi)。檢查時(shí)注意兩側(cè)對(duì)比，利用二維超聲顯示下肢動(dòng)脈縱切面的圖像，將探頭輕輕沿血管走行滑行掃查，測(cè)量?jī)?nèi)-中膜厚度（intima?media thickness，IMT），以IMT ≥ 1 mm作為AS診斷標(biāo)準(zhǔn)，以IMT≥ 1.5 mm為ASP形成標(biāo)準(zhǔn)［3］。見(jiàn)圖1。

1.2.3 DNA提取和基因型檢測(cè)應(yīng)用DNA Purifi?cation Kit提取DNA，具體材料為Promega公司提供的Wizard?Genomic。上游引物為：5′?TGCTTGTG?GGTAAACCAAGGCCGGTG?3′，下游引物為：5′?AA?CACTGAGGTAAGTGGGGGTGGCTCCTGT?3′。之后取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，將反應(yīng)后消化片段在2.5%瓊脂糖凝膠上電泳，所得條帶經(jīng)紫外燈拍照，判定結(jié)果后記錄。

圖1 AS和ASP彩色多普勒超聲對(duì)比圖Fig.1 Contrast image of AS and ASP in color Doppler ultrasonography

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。等位基因和基因型頻率采用直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)，χ2檢驗(yàn)評(píng)估C、T等位基因的Hardy?Weinberg平衡偏離度。Logistic回歸分析評(píng)估NADPH氧化酶p22phox亞基242位點(diǎn)基因突變和其他危險(xiǎn)因素與ASP相關(guān)性。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NADPH氧化酶p22phox亞基242位點(diǎn)基因型結(jié)果NADPH氧化酶p22phox亞基基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為348 bp，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶RSA I酶切后，可見(jiàn)3種基因型，出現(xiàn)348 bp一條帶的為CC純合子基因型，出現(xiàn)348 bp、160 bp、188 bp三條帶的為雜合子CT基因型，出現(xiàn)160 bp、188 bp兩條帶的為TT純合子基因型。見(jiàn)圖2。

圖2 NADPH氧化酶p22phox亞基242位點(diǎn)基因型凝膠電泳圖Fig.2 NADPH oxidase subunit p22phox gene 242 genotype detected by DNA 2.5%agarose gel electrophoresis

2.2 ASNP組和ASP組基因多態(tài)性分布的比較NADPH氧化酶p22phox亞基242位點(diǎn)純合子CC基因頻率與雜合子CT及純合子TT基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.928，P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 ASNP組和ASP組NADPH氧化酶p22phox亞基242位點(diǎn)CC基因型和CT+TT基因型分布比較Tab.1 The frequencies of p22phox242 genotypes and alleles in ASNP group and ASP group

2.3 一般臨床資料比較ASP組SBP（mmHg）顯著高于ASNP組［（166.53 ± 15.74）vs.（154.86 ± 15.16）］mmHg（P＜ 0.05），在是否吸煙方面，ASP組吸煙人數(shù)比例明顯高于ASNP組（P＜0.05），但在DBP、年齡、性別、病程、BMI、FBG和血脂方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 ASNP組和ASP組臨床資料比較Tab.2 Comparison of clinical data between ASNP Group and ASP Group±s

表2 ASNP組和ASP組臨床資料比較Tab.2 Comparison of clinical data between ASNP Group and ASP Group±s

注：BMI，體質(zhì)指數(shù)；SBP，收縮壓；DBP，舒張壓；FBG，空腹血糖；TC，膽固醇；TG，甘油三酯；LDL，低密度脂蛋白；Cr，肌酐；*P＜0.05

項(xiàng)目年齡（歲）男性［例（%）］女性［例（%）］吸煙［例（%）］飲酒［例（%）］病程（年）BMI（kg/m2）SBP（mmHg）DBP（mmHg）FBG（mmol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL（mmol/L）Cr（mmol/L）ASNP（n=191）52.13±10.19 101（52.8）90（47.2）63（33.0）119（62.5）15.76±2.29 24.15±5.01 154.86±15.16 97.35±10.18 10.81±1.43 4.29±1.56 1.48±0.85 2.77±0.39 57.48±38.11 ASP（n=63）54.29±10.11 34（55.4）29（44.6）50（79.4）38（60.9）15.83±2.62 24.11±4.92 166.53±15.74*99.56±10.22 11.60±1.39 4.38±1.40 1.53±0.91 2.75±0.76 55.41±40.06

2.4 ASP危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析將AS患者視為一個(gè)隊(duì)列人群，以是否合并ASP為自變量，年齡、性別、病程、吸煙、飲酒、BMI、SBP、DBP、FBG、TC、TG以及是否存在C242T突變?yōu)橐蜃兞浚M(jìn)行l(wèi)ogistic回歸。表3結(jié)果顯示，病程和吸煙是ASP的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而C等位基因突變是ASP的風(fēng)險(xiǎn)因素，存在C突變的T2DM患者合并ASP風(fēng)險(xiǎn)增高58%。見(jiàn)表3。

表3 ASP危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis of risk Factors of ASP

3 討論

T2DM患者主要表現(xiàn)為糖代謝與脂代謝的雙重紊亂，其高血糖和高血脂狀態(tài)狀態(tài)會(huì)造成血管內(nèi)血小板聚集，血液黏滯度增高，動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生缺血缺氧，最終導(dǎo)致血管屏障功能受損［4］，在彩超上主要表現(xiàn)為動(dòng)脈IMT彌漫性增厚形成AS，嚴(yán)重者形成ASP，繼而造成管腔狹窄、甚至閉塞。

NADPH氧化酶的主要成分是細(xì)胞色素b558，它的輕鏈22 kD多肽（p22phox）被證實(shí)與酶活性密切關(guān)聯(lián)，研究發(fā)現(xiàn)其可以大量生成氧自由基［5］，氧自由基引起的氧化應(yīng)激是血管病變發(fā)病的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)［6］。NADPH氧化酶p22phox亞基242位點(diǎn)的基因突變導(dǎo)致組氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?，這會(huì)產(chǎn)生大量血管內(nèi)皮活性氧ROS［7］；ROS一方面促進(jìn)動(dòng)脈血管基底膜剝脫，造成動(dòng)脈血管足突細(xì)胞死亡［8］，另一方面，它還可以阻止動(dòng)脈血管基質(zhì)降解，促進(jìn)AS甚至ASP的形成，這主要是通過(guò)促使動(dòng)脈血管細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）來(lái)完成的。NADPH氧化酶p22phox亞基242位點(diǎn)基因突變?cè)斐葾S的另外一個(gè)原因就是降低了NADPH氧化酶的活性，導(dǎo)致動(dòng)脈血管細(xì)胞的凋亡和NO的合成減少，引起動(dòng)脈血管痙攣、血小板聚集，斑塊形成［9-10］。

種族和生活環(huán)境的差異被認(rèn)為與疾病差異性密切相關(guān)，朝鮮族飲食習(xí)慣中鹽分含量高，男性喜飲酒、吸煙，這些均被認(rèn)為是造成T2DM的高風(fēng)險(xiǎn)因素。其具體機(jī)制為煙草中的氧自由基等物質(zhì)，會(huì)損傷患者的血管內(nèi)皮，造成血管活性平衡失調(diào)，增加患者血管的僵硬度；另外，煙草中某些成分會(huì)導(dǎo)致患者的膽固醇代謝紊亂，引起血管壁膽固醇清除下降，膽固醇不斷堆積于動(dòng)脈壁，加快動(dòng)脈硬化的發(fā)展［11］，但在本文中并未得出飲酒與動(dòng)脈硬化相關(guān)的結(jié)論，這可能與酒精在某些程度上具有促進(jìn)循環(huán)的作用相關(guān)。另外，入選樣本數(shù)及入選人群中飲酒人數(shù)較少也可能是另一個(gè)原因。至于病程與ASP之間存在相關(guān)性則更好理解，隨著病程的延長(zhǎng)，T2DM患者代謝紊亂日益加重，造成大血管病變是疾病發(fā)生發(fā)展的自然過(guò)程。

隨著基因研究的迅猛發(fā)展，越來(lái)越多的學(xué)者喜歡從遺傳、基因水平解釋疾病易感性的不同。在本研究結(jié)果顯示，在AS和ASP的患者中，NADPH氧化酶p22phox亞基242位點(diǎn)純合子CC基因頻率與雜合子CT及純合子TT基因頻率相比，差異顯著（P＜0.05），這與我們之前研究的該基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈、腎動(dòng)脈、視網(wǎng)膜動(dòng)脈及左心室肥厚相關(guān)的結(jié)果是一致的［12-13］。

通過(guò)本研究，筆者認(rèn)為NADPH氧化酶p22phox亞基C242T基因多態(tài)性與中國(guó)朝鮮族T2DM患者ASP相關(guān)，患者中CC純合子基因是較高的危險(xiǎn)因素。檢測(cè)患者基因型對(duì)于篩查高危人群，早發(fā)現(xiàn)、早治療具有重要意義。而CDUS以其價(jià)廉、無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景，但必須要提出的是操作者術(shù)水平是影響檢測(cè)結(jié)果的一個(gè)重要因素，因此應(yīng)提高檢查者技術(shù)水平，按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行檢查。

由于樣本含量較小時(shí)，實(shí)驗(yàn)所得出的肯定性結(jié)論應(yīng)用于臨床中，依據(jù)不夠全面，因此在接下來(lái)的研究中，將不斷增大樣本含量，繼續(xù)研究NADPH氧化酶p22phox亞基C242T基因多態(tài)性與T2DM患者糖代謝、脂質(zhì)代謝等內(nèi)分泌紊亂的相關(guān)性，進(jìn)一步明確該基因多態(tài)性引起T2DM各種并發(fā)癥的機(jī)制。