姚幫本, 焦 芮, 葉應(yīng)旺

(1.安徽省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院,安徽合肥 230051;2.合肥工業(yè)大學食品科學與工程學院,安徽合肥 230009)

克羅諾桿菌(Cronobacter spp.)屬于腸桿菌科,是一種革蘭氏陰性、周身鞭毛、無芽孢兼性厭氧粗短桿菌。該菌在生活中較為常見,主要寄生于人和動物的腸道中,易引發(fā)新生兒腦膜炎、菌血癥及壞死性小腸結(jié)腸炎等嚴重疾病[1-3]。至2002年,美國流行病調(diào)查數(shù)據(jù)表明,新生兒感染克羅諾桿菌的概率為十萬分之一,而感染后的死亡率達到20% ～50%[4-5]?？肆_諾桿菌具有極強的逆境耐受性,在自然界中的分布極其廣泛,從多種食物原材料、半成品、生產(chǎn)器材等中都分離到該菌[5-9]。截止目前,克羅諾桿菌在自然界的污染來源仍不清楚,因此,開展不同食品中的污染調(diào)查及預(yù)防控制,對保障食品安全意義重大。

克羅諾桿菌生物膜形成是其在載體表面生活時所采取的一種獨特的生活方式,它是細菌在不利環(huán)境中自我保護的一種本能反應(yīng)[10]。鞭毛是細菌的主要運動器官,細菌往往通過它移向更適宜生長的環(huán)境,避開一些有害無益的影響因子[10]。菌膜的形成與鞭毛運動性都會使細菌朝著更加耐藥、更加易繁殖的方向發(fā)展,所以這兩者之間的相關(guān)性日益受到重視[11]。有關(guān)鞭毛運動特性促進細菌菌膜形成的相關(guān)報道已有很多。研究發(fā)現(xiàn),運動缺陷型的銅綠假單胞菌在其菌膜形成的初始階段黏附載體的能力有所下降[12]。進一步研究發(fā)現(xiàn),生物膜形成能力下降是由于突變基因PA5017抑制了該菌鞭毛運動性與趨化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[13]。除此之外,在枯草芽孢桿菌、創(chuàng)傷弧菌及大腸埃希菌的突變株中均發(fā)現(xiàn)這種由于鞭毛運動缺陷而導(dǎo)致菌膜形成障礙的實例[14-16]。本研究主要對合肥各大超市中水產(chǎn)品進行隨機抽樣,運用改良的國標方法及16S r RNA基因鑒定方法確定其中克羅諾桿菌的檢出率,研究分離菌株的生物膜形成能力與菌株鞭毛運動性之間的關(guān)系?？肆_諾桿菌菌膜的形成是一個復(fù)雜的過程,鞭毛的運動特性是否與生物膜的形成有著某些必然聯(lián)系還待考證。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

試劑：緩沖蛋白質(zhì)胨水(BPW)、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(mLST)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、營養(yǎng)肉湯(NB)、酵母提取粉、瓊脂粉、D型葡萄糖,均購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司;結(jié)晶紫、乙酸,購自國藥集團化學試劑有限公司;2.5%戊二醛固定液,購自北京雷根生物技術(shù)有限公司;PCR mix、TAE緩沖液、溴化乙啶,購自上海生工生物工程有限公司;DNA marker(DL 2000)、DNA提取試劑盒,購自天根生化科技有限公司;LIVE/DEAD baclight bacterial viability kit試劑盒,購自Thermo Fisher Scientific公司。

材料：水產(chǎn)干制品,購自合肥市各大超市;96孔細胞培養(yǎng)板、24孔細胞培養(yǎng)板,購自上海百研生物技術(shù)有限公司。6 mm×6 mm細胞爬片,購自晶安生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

10.0 ～1 000.0μL各種規(guī)格移液槍,深圳市福田區(qū)銘川儀器儀表經(jīng)營部;酶標儀,美國Thermo公司;LMS710型激光共聚焦顯微鏡,德國Zeiss公司;Bio-rad型梯度PCR儀、LDZX-30KBS型高壓滅菌鍋,上海申安公司;SCILOGEX型臺式離心機,美國賽洛捷克公司;UTP-313型電子天平,上海菲克蘇公司;JB-CJ-1FD型超凈臺,蘇州蘇凈公司;天能凝膠成像儀、SU8020型場發(fā)式掃描電鏡,日本日立公司;ZHWY-103B型搖床,上海智城公司;DHG-9070A型電熱鼓風干燥箱,上海昕儀公司;電子游標卡尺,上海美耐特有限公司;SHP-80型恒溫培養(yǎng)箱,上海森信公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品調(diào)查方案

采樣時間：2015年6月29日—9月10日;采樣地點：安徽省合肥市各大型超市。

共6批次120份樣品,主要為超市中散裝與包裝的干制海產(chǎn)品。

計劃采樣的前一天,配制實驗所需的各種培養(yǎng)基以及對一些處理樣品的必需品進行滅菌。早上9時去超市采樣,此時超市剛開始營業(yè),可以盡可能排除一些人為及環(huán)境因素的影響。

樣品的預(yù)處理：采樣后及時將其帶回實驗室,首先進行編號,隨后裁樣(有些干制水產(chǎn)品很大,需將其用滅過菌的剪刀剪成小塊),再裝入無菌的密封袋中進行密封保存。需要保存在相對低溫且干燥的地點,以待下一步鑒定時使用。

1.3.2 樣品中克羅諾桿菌污染檢測

克羅諾桿菌的篩選檢測流程依照 GB 4789.40—2016[17]中阪崎腸桿菌微生物學檢驗國家標準進行。由于調(diào)查樣品的特殊性及對實驗的特殊要求,對檢測標準的某些細節(jié)進行了更改。操作步驟如下：

1)增菌。無菌環(huán)境下準確稱取3.0 g樣品,加入到50 mL BPW中,放在100 mL的三角瓶中搖勻,隨后放置在180 r/min搖床中,37℃下培養(yǎng)20 h。

2)初步篩菌。將萬古霉素(1 mg/mL)經(jīng)過0.22μm孔徑的水系濾膜過濾,按照國標與月桂基硫酸鹽培養(yǎng)基混合。取1 mL 1)中的增菌液轉(zhuǎn)移至10 mL mLST中,放置于搖床中以180 r/min,44℃恒溫培養(yǎng)24 h。

3)分離。取上一步的培養(yǎng)物在克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基平板上劃線,放置在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。觀察顯色培養(yǎng)基平板上是否存在呈藍綠色的典型菌落。

4)鑒定。在每個顯色培養(yǎng)基平板中間位置挑取1～5個典型及可疑菌落進行甘油保存。

5)菌落PCR。取篩選出的菌種于TSA上劃線過夜培養(yǎng),用牙簽挑取少量單菌落于EP管中。挑取菌體不易過多,EP管中可見淡淡痕跡即可,挑取菌體量過多反而易干擾實驗,造成非特異性擴增等不良后果。

6)PCR反應(yīng)體系及電泳條件。PCR反應(yīng)基于gluA基因設(shè)計引物[18]。 E-F：5'-ggcggagccgaataactg-3';E-R：5'-cgtgccctgcatgagaaaa-3'。

PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94℃,預(yù)變性10 min;94℃,變性45 s,58℃,退火45 s,72℃延伸1 min,共35個循環(huán);72℃,延伸7 min結(jié)束反應(yīng)。

PCR體系組成：2×Taq PCR Master Mix(20 μL),E-F和E-R各0.2μmol/L,模板DNA 1μL,雙蒸水17μL。

電泳條件：取菌落 PCR的擴增產(chǎn)物5μL及DNA Marker 5μL,點樣于含有核酸染料溴化乙啶的1%瓊脂糖凝膠梳子孔中,加入1×電泳緩沖液TAE,120 V電泳約為20～30 min,通過凝膠成像儀觀察,并進行測序鑒定。

1.3.3 分離菌株的生物學特性研究

1.3.3.1 分離菌株菌膜形成能力測定

將1.3.2中鑒定出的克羅諾桿菌分離株經(jīng)過TSB的擴增培養(yǎng)后,在TSA上劃線后放置在恒溫培養(yǎng)箱37℃倒置培養(yǎng),隨后挑取單菌落接種于5 mL的TSB中進行過夜活化。取分離株過夜活化后的菌液以1∶100的比例與新鮮TSB混合,混合均勻后轉(zhuǎn)移至96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),每孔加樣200μL。每種濃度均在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h。每種濃度重復(fù)3～6次,并設(shè)置無菌液的新鮮培養(yǎng)基為空白對照組。培養(yǎng)后的96孔細胞培養(yǎng)板的處理步驟如下：

1)棄去96孔細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液,使用無菌生理鹽水反復(fù)清洗未貼壁的浮游細菌3次;

2)將清洗好的細胞培養(yǎng)板置于60℃的恒溫鼓風烘箱中固定1 h;

3)在固定好的細胞培養(yǎng)板的每個處理孔中加入200μL的0.1%結(jié)晶紫染液(配制好的結(jié)晶紫應(yīng)避光保存)避光染色30 min;

4)將染過色的細胞培養(yǎng)板用0.90%無菌生理鹽水清洗3～6次,盡量將染壁的結(jié)晶紫洗干凈;

5)室溫風干后溶解于33%的乙酸中(現(xiàn)測現(xiàn)配現(xiàn)加原則),若不能立刻測量則風干后直接放置于4℃冰箱中;

6)溫和震蕩細胞培養(yǎng)板并置于酶標儀下測定吸光度,測定波長為590 nm。

1.3.3.2 分離菌株菌膜觀察

1)電鏡觀察分離菌株的菌膜生長情況。將活化過的菌液以1∶100的比例與新鮮TSB混合均勻,轉(zhuǎn)移至24孔細胞培養(yǎng)板中,每孔加入2 mL。24孔細胞培養(yǎng)板預(yù)先放入直徑為6 mm無菌的細胞爬片作為黏附載體。每種濃度均在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h。每種濃度重復(fù)3～6次,并設(shè)置無菌液的新鮮培養(yǎng)基為空白對照組。培養(yǎng)結(jié)束后,菌膜的掃描電鏡樣品前處理步驟如下：

①先緩慢沿壁吸取細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基后棄去,用無菌PBS輕輕沖洗細胞培養(yǎng)板3次,在清洗過程中可以輕輕晃動培養(yǎng)板洗去浮游菌;

②清洗完畢后加入2.5%戊二醛過夜固定,固定時間不少于6 h;

③將固定后的樣品用無菌PBS溶液輕輕沖洗3次;

④乙醇梯度脫水,乙醇的體積分數(shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%、100%,樣品加入每個濃度的乙醇后需脫水放置10 min,每個濃度重復(fù)2次;

⑤將乙醇脫水后的樣品放置于-20℃冰箱中預(yù)冷不少于4 h;

⑥將預(yù)冷后的樣品置于冷凍干燥機中12 h,取出后放置于干燥器中;

⑦樣品噴金100 s后,利用場發(fā)式掃描電鏡在3 000倍下掃描拍攝。

2)激光共聚焦觀察分離株的菌膜生長情況。首先培養(yǎng)分離菌株的菌膜,具體菌膜培養(yǎng)方法及條件參照1.3.3.2中的1)。菌膜激光共聚焦樣品前處理步驟如下：

①將培養(yǎng)后3個時間段的各組模型中培養(yǎng)液取出,用無菌的生理鹽水輕輕洗滌細胞板中細胞爬片3次,緩慢搖晃除去浮游細菌。

②在細胞培養(yǎng)板中加入配制好的熒光染液(1 mL混合熒光染液的比例為：994μL PBS+3μL染液1+3μL染液2),37℃恒溫培養(yǎng)箱避光條件下培養(yǎng)15 min。

③將染色后細胞爬片用無菌生理鹽水洗滌3次,洗去染料。

④將處理好的細胞爬片取出,倒置于0.17 mm厚的載玻片上。置于激光共聚焦顯微鏡下,采用藍光激發(fā),拍照。Syto9染料呈綠色熒光,表示活菌;碘化丙啶PI染料呈現(xiàn)紅色熒光,表示死菌。根據(jù)比例可以觀察細菌菌落大致形成情況。

1.3.3.3 分離菌株運動能力測定

篩選菌株運動能力的測定主要使用兩種培養(yǎng)基,第一種是游動性培養(yǎng)基(swimming motility),第二種是泳動性培養(yǎng)基(swarming motility)。11號分離株過夜擴菌后,在TSA劃線培養(yǎng)出單菌落。用牙簽輕輕點擊單菌落,隨后分別點擊到swimming motility和swarming motility上,且點擊在培養(yǎng)基上的次數(shù)必須保證相同。將兩種培養(yǎng)基放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),swimming motility及swarming motility分別培4 h和16 h即可。兩種培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中均不可疊加放置。

具體培養(yǎng)基配制如下：

1)游動性培養(yǎng)基(swimming motility)。細菌用胰蛋白胨,10 g/L;酵母提取粉,5 g/L;瓊脂粉,0.15%。加蒸餾水定容至1 L,121℃濕熱滅菌20 min。需要測定克羅諾桿菌游動性之前,加熱凝固的培養(yǎng)基,融化后冷卻至50℃左右倒平板,平板的厚度約為4 mm左右,冷卻凝固后備用。由于培養(yǎng)基中瓊脂粉較少,屬于軟平板,所以移動平板時需要柔和平穩(wěn)移動,不可傾斜和倒置。

2)泳動性培養(yǎng)基(swarming motility)。營養(yǎng)肉湯,8 g/L;D-葡萄糖,5 g/L;瓊脂粉,0.5%。加蒸餾水定容至1 L,115℃濕熱滅菌30 min。需要測定克羅諾桿菌泳動性之前,加熱凝固的培養(yǎng)基,融化后冷卻至50℃左右倒平板,平板的厚度約為3 mm左右,冷卻,干燥過夜,因培養(yǎng)基屬于半固體,平板不可倒置。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離與鑒定結(jié)果分析

克羅諾桿菌在顯色培養(yǎng)基生長及顯色情況見圖1?？肆_諾桿菌區(qū)別于其他腸桿菌的特性之一是該菌具有α-葡萄糖苷酶活性,這種活性會使其在培養(yǎng)基上產(chǎn)生黃色菌落,但與此同時產(chǎn)生的4-硝基苯酚會影響結(jié)果[19-20]。Iversen等[21]通過在培養(yǎng)基中加入顯色基團Xα-GlcA,配制成克羅諾桿菌的特異性顯色培養(yǎng)基,使得該菌在培養(yǎng)基中顯藍綠色(圖中圓圈部分)。由圖1可見藍綠色的單菌落,120個調(diào)查樣品共有37個樣品有藍綠色菌落,此次調(diào)查初篩時目的菌株的檢出率為30.83%。每個顯色培養(yǎng)基中挑取3～5個單菌落過夜活化后用甘油保存。共保存了129個疑似克羅諾桿菌菌落,以待用作后續(xù)的鑒定工作。

圖1 克羅諾桿菌在顯色平板上的藍綠菌落(圓圈中)形態(tài)Fig.1 Shape of Cronobacter spp.on chromogenic medium

圖2 克羅諾桿菌屬gluA鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of gluA for Cronobacter spp.

為防止假陽性與假陰性,因此設(shè)置陽性對照與陰性對照,本實驗設(shè)置了一個已知的克羅諾桿菌G362作為對照。疑似菌株的DNA擴增結(jié)果見圖2。由圖2可見,23個菌株有目的條帶(673 bp),檢出率為17.83%。陸幸兒等[22]在廣東省各超市共328家對10種食物(包括冰淇淋、熟肉、面包、飲用水、調(diào)味品、堅果等)進行取樣調(diào)查,最后檢出阪崎克羅諾桿菌54株,總檢出率達到6.4%,小于17.83%。兩者都是從各大超市隨機采集樣品,調(diào)查結(jié)果說明,該菌對海產(chǎn)干制品的污染率較高。海產(chǎn)干制品中含鹽量較高,卻仍有較高的檢出率,這可能與該菌的耐高滲透壓有關(guān)。Breeuwer等[23]的研究結(jié)果表明,克羅諾桿菌確實能耐受極端滲透壓和干燥環(huán)境。

2.2 分離菌株的生物學特性分析

2.2.1 分離菌株菌膜形成能力分析

細菌形成生物膜是為了適應(yīng)生存環(huán)境而產(chǎn)生的多糖類物質(zhì),該物質(zhì)黏附于載體(生物或非生物)表面,菌體包被于自身所產(chǎn)生的質(zhì)地不均一的基質(zhì)中,從而形成一種完全不同于浮游細菌生長模式的細菌群體[10]。這種菌膜結(jié)構(gòu)就如同一種“保護屏障”,對宿主的免疫系統(tǒng)的抵抗性有著顯著的影響,是發(fā)生慢性感染的因素之一[24]。

23株克羅諾桿菌分離株的菌膜形成能力見圖3。由圖3可見,編號為11的分離株菌膜形成能力尤為突出。菌膜形成能力的強弱在某種程度上可以表示菌株對外來不利因素的抵抗能力的強弱,因此將編號為11號的分離株待定為后續(xù)實驗的實驗菌株。

2.2.2 11號分離株菌膜形成能力觀察

圖3 克羅諾桿菌分離菌株菌膜的形成能力Fig.3 Biofilm formation abilities of Cronobacter spp.strains

圖4 掃描電鏡表征的11號分離株的菌膜形成能力Fig.4 Biofilm formation ability of No.11 strain using scanning electron microscopy

細菌菌膜的形成是一個復(fù)雜的動態(tài)過程,包括細菌起始的黏附、菌膜黏附期、生長期、成熟期、播散期等一系列階段[25]。分離株的菌膜形成見圖4、圖5。由圖4與圖5可看出,隨著時間的不斷延長,在一定時間段間,菌膜形成的厚度增加且死菌的比例也逐漸增加。另外還可觀察到生物膜中間存在空隙與孔道,有研究認為該孔道為細菌正常新陳代謝的重要通道,分布著多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)[1]。除此之外,由圖4可觀察到分離株在不同時間段時菌膜的生長情況。24 h時,菌膜形成的初始階段,菌體大量繁殖并且開始聚集黏附在載體表面;當培養(yǎng)時間達到48 h時,可觀察到成片的菌膜,菌膜結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)固,中間的空隙較少,此時菌膜形成量達到最大值;隨著時間的繼續(xù)推移,72 h的培養(yǎng)后,菌膜開始裂解,釋放其中的菌體。圖5結(jié)果基本上與圖4一致,24 h時菌體呈鮮綠色,說明此時菌體生長較為旺盛,黏附載體的能力也較強,并開始有成膜的趨勢;48 h時開始出現(xiàn)死菌但也是菌膜生成量最大的時候,在激光共聚焦下出現(xiàn)成塊和成片的黃綠色菌膜;當11號分離株培養(yǎng)時間達到72 h時,此時Syto9染料所表征的綠色活菌比例下降,而PI所表征的紅色死菌比例大大上升,而此時菌膜已經(jīng)裂解,菌體被釋放出來,已無成片完整的黃綠色菌膜。

2.2.3 分離株運動性分析

圖5 激光共聚焦顯微鏡表征的11號分離株的菌膜形成能力Fig.5 Biofilm formation ability of No.11 strain using confocal laser scanning microscopy

圖6 克羅諾桿菌分離株的游動性Fig.6 Swimming motilityies of Cronobacter spp.

圖7 克羅諾桿菌分離株的泳動性Fig.7 Swarming motility of Cronobacter spp.

圖8 克羅諾桿菌在運動培養(yǎng)基中的運動狀態(tài)Fig.8 Shape of Cronobacter spp.in motility medium

鞭毛是細菌的主要運動器官,細菌的運動往往有一定的趨向性,大多數(shù)細菌會依賴鞭毛運動到更適宜生長的方向,從而擁有更充足的營養(yǎng)物質(zhì),而避開有害的環(huán)境[10]。分離株的運動情況見圖6至圖8。由圖6至圖8可知,8號菌株與18號菌株在swimming motility上培養(yǎng)4 h后形成的菌落圈分別達到23株分離株的最大值(55.75 mm)與最小值(32.14 mm);而11號菌株與16號菌株在swarming motility上培養(yǎng)16 h后形成的菌落圈分別達到23株分離株的最大值(14.02 mm)與最小值(7.85 mm)。

鞭毛的運動性與菌體菌膜的形成有一定關(guān)系。通過比較8株大腸埃希菌菌毛基因的表達和生物膜形成相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)細菌的運動性與菌膜的形成存在對應(yīng)關(guān)系,運動性越強的菌株,其生物膜形成能力相對越強[16];而Caiazza等[25]研究發(fā)現(xiàn),SadB蛋白缺陷菌株運動能力增強,菌膜形成能力反而減弱。

此次調(diào)查取樣中,所篩選的23株克羅諾桿菌分離株生物膜形成與其運動能力之間的關(guān)系不是很顯著,可能是由于克羅諾桿菌菌膜生成情況受到多種因素的影響。鞭毛的運動性雖然在一定程度上可以使菌體朝向高營養(yǎng)物質(zhì)處移動,盡量避開不利因素,但是在細菌黏結(jié)在載體表面時,運動性又會抑制其形成穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)[11]。

3 結(jié) 論

抽樣調(diào)查了120個海產(chǎn)干制樣品,運用改良的國標檢測方法與分子水平鑒定分離株,發(fā)現(xiàn)其中克羅諾桿菌的檢出率為17.83%,表明海產(chǎn)干貨中克羅諾桿菌具有較高的污染率。進一步研究了23個分離菌株的菌膜形成能力與運動能力之間的關(guān)系,結(jié)果表明,11號菌株的菌膜形成能力最強并且有較強的運動性,但克羅諾桿菌菌膜形成與其鞭毛運動性之間的關(guān)系還未明確,詳細的分子機制尚待深入研究。