夏俊芳，潘 苗，奇那爾，瑪格撇爾，古麗娜孜，武 運(yùn)

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是一種常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性食源性病原體，廣泛分布于各種環(huán)境中，并形成耐酸、耐熱和耐干燥的孢子[1]。該病原菌會(huì)引起全身感染和食物中毒，如腹瀉、嘔吐、腦膜炎、敗血癥、眼內(nèi)炎和牙周炎等[2]。Bacillus cereus經(jīng)常在生鮮乳及加工乳中被發(fā)現(xiàn)且可以附著在加工機(jī)械的表面，如閥門(mén)、管道和泵等，甚至形成菌膜，菌膜中的病原體對(duì)機(jī)械作用或常用消毒劑具有較強(qiáng)的抵抗力，會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的健康風(fēng)險(xiǎn)，人體大約80%的細(xì)菌感染與菌膜有關(guān)[3]。在乳品加工線上形成的Bacillus cereus菌膜會(huì)增加該菌反復(fù)污染的風(fēng)險(xiǎn)，降低乳制品的質(zhì)量，導(dǎo)致食品腐敗從而引起食品安全問(wèn)題[4]，對(duì)乳制品行業(yè)造成極大的威脅[5]。如何徹底消除乳品環(huán)境中的菌膜已成為一大挑戰(zhàn)[6]，為此，了解Bacillus cereus菌膜的形成至關(guān)重要，制定合理的方案以消除乳品加工業(yè)中Bacillus cereus菌膜的污染問(wèn)題。

目前，關(guān)于Bacillus cereus菌膜形成的研究主要集中在內(nèi)部因素和外部因素兩個(gè)方面，內(nèi)部因素如Sin R[7]、Cod Y[8]、Sigma54（RpoN）[9]基因編碼的蛋白質(zhì)被認(rèn)為參與Bacillus cereus菌膜的形成，外部因素包括酸堿度、溫度、營(yíng)養(yǎng)成分和細(xì)菌特性等[10?11]。CORCIONIVOSCHI等[12]通過(guò)對(duì)細(xì)菌Noxs研究綜合分析后（Noxs是可以專(zhuān)一催化產(chǎn)生活性氧（ROS）酶類(lèi)）提出，Noxs介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS可能是細(xì)菌的一種重要信號(hào)分子，ROS可能參與食源性致病菌菌膜的形成，細(xì)菌菌膜形成中通常會(huì)伴隨ROS的產(chǎn)生，但其對(duì)菌膜形成的影響尚無(wú)定論，如SHIVAPRASAD等[13]研究發(fā)現(xiàn)維生素C通過(guò)產(chǎn)生ROS使大腸桿菌（Escherichia coli）EMC17菌株氧化應(yīng)激抑制其菌膜形成，菌膜基因表達(dá)下調(diào)；SUO等[14]研究發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶缺失的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）突變體中ROS生成量升高，菌膜形成能力顯著下降；WHITE等[15]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫酶（katA）基因破壞的奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）ROS水平增加，菌膜生物量減少，但KULKARNI等[16]發(fā)現(xiàn)香煙煙霧（ROS存在）下增加金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌膜的形成；VILLA等[17]指出持續(xù)的外源ROS處理增加棕色固氮桿菌（Azotobacter vinelandii）野生型菌株（UW136）菌膜形成。WANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)Bacillus cereus（ATCC14579）在黃素腺嘌呤二核苷酸刺激下增大Nox2轉(zhuǎn)化率，證實(shí)Bacillus cereus中存在Noxs活性，活性部位存在于細(xì)胞膜上，因此，ROS與Bacillus cereus菌膜的形成和基因調(diào)控相關(guān)，但ROS在Bacillus cereus代謝或菌膜形成中的確切作用仍不清楚，且多數(shù)研究中的菌株并非來(lái)源于食品分離菌株，菌株差異性導(dǎo)致研究結(jié)果對(duì)實(shí)際指導(dǎo)的意義有限。

本文以新疆烏魯木齊夏秋兩季市售原料奶中Bacillus cereus分離株為研究目標(biāo)，通過(guò)外源H2O2、N-乙酰半胱氨酸（NAC）ROS清除劑、二苯基氯化碘（DPI）NADPH氧化酶抑制劑處理Bacillus cereus，探討ROS與Bacillus cereus菌膜形成之間的關(guān)系，為后期食品加工、運(yùn)輸過(guò)程中Bacillus cereus菌膜污染的有效控制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus） 菌株N2、N6，菌株Y10、Y22、Y34，菌株L6、L8、L9、L12、L24根據(jù)國(guó)標(biāo)（GB4789.14-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)）分別從新疆烏魯木齊零市售新鮮牛乳、羊乳及驢乳分離篩選，菌株甘油管凍存于?80 ℃冰箱備用。Bacillus cereus（CMCC63303）（BC） 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋生物技術(shù)有限公司；0.1%結(jié)晶紫 分析純，廣東光華科技股份有限公司；NAC（N-乙酰半胱氨酸） 上海源葉生物科技有限公司；碘化丙啶（PI）試劑、二苯基氯化碘鹽（DPI） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴化物（MTT） 貝奧替米生物技術(shù)公司（中國(guó)上海）；95%乙醇 成都市科隆化學(xué)品有限公司；過(guò)氧化氫（H2O2）、2.7二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO） 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

HR40-IIA2生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司；Tu-1810APC分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LE2002E/02電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LDZX-50KBS型高壓滅菌鍋 上海早安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；THZ-98AB恒溫培養(yǎng)振蕩箱、DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MX-E渦旋振蕩器 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京有限公司；PHS-3C數(shù)顯臺(tái)式酸度計(jì) 上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；Tecan多功能酶標(biāo)儀（Spark） 奧地利Tecan Austria GmbH公司；生物激光共聚焦顯微鏡（TCS SP8） 德國(guó)徠卡公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 奶源Bacillus cereus菌株的活化培養(yǎng) 將甘油管凍存的Bacillus cereus菌株進(jìn)行活化，以0.1%接種量分別接入10 mL LB液體培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)18 h后，用新鮮LB培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600為0.3，于4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌活力及細(xì)胞活性測(cè)定 將OD600為0.3的Bacillus cereus菌液接入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔100 μL，30 ℃培養(yǎng)24 h后測(cè)量細(xì)菌濃度（OD600）為細(xì)菌活力值，然后向每孔添加20 μL 0.5 mg/mL MTT密封后30 ℃反應(yīng)4 h離心（4000 r/min，10 min）棄上層液體，再向每孔加150 μL二甲亞砜（DMSO），震蕩溶解藍(lán)色結(jié)晶，在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔光密度，以所有菌株細(xì)胞活性（MTT）均值繪圖。

1.2.3 菌膜測(cè)定 采用96孔結(jié)晶紫染色法[19]測(cè)定菌膜含量，將OD600為0.3的Bacillus cereus菌液接入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，平行接種5個(gè)孔，以相同條件的無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，30 ℃下培養(yǎng)24 h后移除菌液，用無(wú)菌蒸餾水洗滌3次，室溫靜置30 min，然后向每孔中加入100 μL 0.1%結(jié)晶紫溶液，染色30 min后棄去結(jié)晶紫溶液，用無(wú)菌蒸餾水洗滌3次并室溫靜置干燥，再向每孔加入110 μL 95%乙醇溶液，脫色45 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)下吸光值，根據(jù)OD570值的大小衡量菌膜的形成量，分別進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。按照STEPANOVIC等[20]的菌膜劃分標(biāo)準(zhǔn)，以空白對(duì)照（空白孔）平均吸光值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差為界定值（ODc），將菌株的菌膜形成能力劃分為4個(gè)等級(jí)：OD570≤ODc，菌膜陰性；ODc

1.2.4 ROS測(cè)定 采用DCFH-DA（2，7二氯熒光素二乙酸酯）法進(jìn)行ROS測(cè)量[19]，向形成菌膜的96孔板中加入10 μmol/L的DCFH-DA，30 ℃避光培養(yǎng)30 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的熒光值（激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)530 nm），以所有菌株ROS的均值繪圖。

1.2.5 H2O2對(duì)Bacillus cereus菌膜形成的影響 將H2O2加入OD600為0.3的Bacillus cereus菌液中，使H2O2終濃度為0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L，混勻后，分別取100 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)5個(gè)平行，密封后靜置于30 ℃培養(yǎng)箱，24 h培養(yǎng)后按照1.2.2、1.2.3、1.2.4進(jìn)行細(xì)菌活力及細(xì)胞活性測(cè)定、菌膜測(cè)定、ROS測(cè)定。

1.2.6 N-乙酰半胱氨酸（NAC）對(duì)Bacillus cereus菌膜形成的影響 將NAC加入OD600為0.3的Bacillus cereus菌液中，使NAC終濃度為0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1 mmol/L，混勻后，分別取100 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)5個(gè)平行，密封后靜置于30 ℃培養(yǎng)箱，24 h培養(yǎng)后按照1.2.2、1.2.3、1.2.4進(jìn)行細(xì)菌活力及細(xì)胞活性測(cè)定、菌膜測(cè)定、ROS測(cè)定。

1.2.7 二苯基氯化碘鹽（DPI）對(duì)Bacillus cereus菌膜形成的影響 將DPI加入OD600為0.3的Bacillus cereus菌液中，使DPI終濃度為0、0.05、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L，混勻后，分別取100 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)5個(gè)平行，密封后靜置于30 ℃培養(yǎng)箱，24 h后培養(yǎng)后按照1.2.2、1.2.3、1.2.4進(jìn)行細(xì)菌活力及細(xì)胞活性測(cè)定、菌膜測(cè)定、ROS測(cè)定。

1.2.8 激光共聚焦顯微鏡測(cè)定菌膜形成 將1 mL OD600為0.3的Bacillus cereus（CMCC63303）菌液接入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中作為對(duì)照組，分別添加終濃度為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L H2O2，終濃度為0.0001、0.001、0.01、0.1、1 mmol/L NAC，終濃度為0.05、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L DPI為處理組，置于30 ℃培養(yǎng)箱，24 h培養(yǎng)后用無(wú)菌蒸餾水洗滌3次，室溫靜置45 min后用碘化丙啶（PI）熒光染液封片，然后用激光共聚焦顯微鏡觀察菌膜形成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，采用Statistix 8.1（分析軟件，St Paul，MN）軟件包中Linear Models程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Dun檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較確定差異顯著性，應(yīng)用Excel 2016和Adobe illustrator 2020制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2對(duì)Bacillus cereus生長(zhǎng)及菌膜形成的影響

由圖1可知，隨著H2O2濃度的升高，細(xì)菌活力逐漸下降，所有H2O2處理組（0.01、0.1、1、10、100 μmol/L）Bacillus cereus活力顯著低于對(duì)照組細(xì)菌活力（P<0.05）。由圖1細(xì)胞活性變化趨勢(shì)可知，當(dāng)H2O2濃度≥1 μmol/L時(shí)，Bacillus cereus細(xì)胞活性顯著高于H2O2低濃度處理組（0.01、0.1 μmol/L）細(xì)胞活性（P<0.05），表明較高濃度的H2O2對(duì)細(xì)胞活性有一定的促進(jìn)作用。

圖1 不同H2O2濃度對(duì)蠟樣芽孢桿菌活力和細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of different H2O2 concentration on vigor and viability of Bacillus cereus

由圖2可知，0.01、1、100 μmol/L H2O2處理組平均菌膜形成量均高于對(duì)照組平均水平（P<0.05）。0.01 μmol/L H2O2處理時(shí)，Y10、Y22、Y34菌株形成較強(qiáng)菌膜，BC、N6、L9、L12、L24菌株形成中等菌膜，N2、L6、L8菌株形成較弱菌膜；1 μmol/L H2O2處理時(shí)，BC、N2、N6、Y10、L24菌株形成較強(qiáng)菌膜，Y22、Y34、L6、L9、L12菌株形成中等菌膜，L8菌株形成較弱菌膜；100 μmol/L H2O2處理時(shí)，BC、N2、N6、Y10、Y22、Y34、L8、L12、L24菌株形成較強(qiáng)菌膜，L6、L9形成中等菌膜。

由圖2可知，0.1、10 μmol/L H2O2處理組平均菌膜形成量與對(duì)照組平均菌膜水平無(wú)顯著性差異（P>0.05）。0.1 μmol/L H2O2處理時(shí)，BC、N6、Y10、Y22、Y34、L12、L24菌株形成中等菌膜，N2、L6、L8、L9形成較弱菌膜；10 μmol/L H2O2處理時(shí)，BC、Y10、Y22、Y34、L24菌株形成中等菌膜，N2、N6、L6、L8、L9、L12菌株形成較弱菌膜；對(duì)照組N2、N6、Y10、L9、L12菌株形成中等菌膜，BC、Y22、Y34、L6、L8、L24菌株均形成較弱菌膜?？梢?jiàn)部分濃度H2O2處理促進(jìn)Bacillus cereus菌膜形成。

圖2 不同H2O2濃度對(duì)蠟樣芽孢桿菌ROS產(chǎn)生及菌膜形成的影響Fig.2 Effect of different H2O2 concentration on ROS production and biofilms formation of Bacillus cereus

由圖2 ROS變化趨勢(shì)可知，隨著H2O2濃度的升高，ROS逐漸下降。盡管外源補(bǔ)充H2O2但ROS水平并未提高，這可能是因?yàn)锽acillus cereus對(duì)這種外源氧化壓力作出應(yīng)答且菌體本身也在不斷產(chǎn)生和消耗ROS，因此，即使外源補(bǔ)充100 μmol/L H2O2，ROS含量仍呈下降趨勢(shì)。這與REDER等[21]的研究發(fā)現(xiàn)一致，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌膜相關(guān)基因突變株經(jīng)百草枯和H2O2等超氧化物生成劑處理后ROS含量顯著減少（P<0.05）。結(jié)果表明：伴隨著ROS含量的降低，Bacillus cereus菌膜形成量增強(qiáng)，因此，Bacillus cereus菌膜形成與ROS的減少相關(guān)。

2.2 NAC對(duì)Bacillus cereus生長(zhǎng)及菌膜形成的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，NAC各處理組Bacillus cereus活力顯著低于對(duì)照組細(xì)菌活力（P<0.05），各處理組間細(xì)菌活力無(wú)顯著差異（P>0.05）。NAC 各處理組細(xì)胞活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P>0.05），表明NAC處理濃度對(duì)Bacillus cereus的生長(zhǎng)和細(xì)胞活性的影響不大。這與GUO等[22]研究發(fā)現(xiàn)NAC處理組濃度對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的生長(zhǎng)和生存能力沒(méi)有影響的結(jié)果一致。

圖3 不同NAC濃度對(duì)蠟樣芽孢桿菌活力和細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effect of different NAC concentration on vigor and viability of Bacillus cereus

由圖4可知，NAC各處理組平均菌膜形成量均顯著高于對(duì)照組平均菌膜形成量（P<0.05）。各處理組間相比，0.0001 mmol/L NAC處理組及

0.001 mmol/L NAC處理組平均菌膜形成量最高，0.01 mmol/L NAC處理組平均菌膜形成量最低。

當(dāng)0.0001 mmol/L NAC處理時(shí)，Y22、Y34菌株形成較強(qiáng)菌膜；0.001 mmol/L NAC處理時(shí)，N6、Y22、L12菌株形成較強(qiáng)菌膜；0.1 mmol/L NAC處理時(shí)，Y22菌株形成較強(qiáng)菌膜；1 mmol/L NAC處理時(shí)，Y10菌株形成較強(qiáng)菌膜；0.01 mmol/L NAC處理時(shí)，L9、L24菌株形成較弱菌膜，其他9株菌均形成中等菌膜；對(duì)照組N2、N6、Y10、L9、L12菌株形成中等菌膜，BC、Y22、Y34、L6、L8、L24菌株均形成較弱菌膜。

由圖4 可知，隨NAC濃度的升高，ROS逐漸下降。這是因?yàn)镹AC是ROS的清除劑，隨著NAC濃度的增大，ROS含量逐漸減小，但Bacillus cereus菌膜形成量增大。這與GUERINI等[23]研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌膜隨NAC濃度（0.5～4.0 mg/mL）增加而增加的結(jié)果一致。結(jié)果表明，Bacillus cereus菌膜形成與ROS的減少相關(guān)。

圖4 不同NAC濃度對(duì)蠟樣芽孢桿菌ROS產(chǎn)生及菌膜形成的影響Fig.4 Effect of different NAC concentration on ROS production and biofilms formation of Bacillus cereus

2.3 DPI對(duì)Bacillus cereus生長(zhǎng)及菌膜形成的影響

由圖5可知，隨著DPI濃度的升高，細(xì)菌活力逐漸下降，所有DPI處理組（0.05、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L）Bacillus cereus活力顯著低于對(duì)照組細(xì)菌活力（P<0.05）。由圖5細(xì)胞活性變化趨勢(shì)知，隨著DPI濃度的升高，細(xì)胞活性也逐漸減弱，當(dāng)DPI濃度大于1 μmol/L時(shí)，Bacillus cereus細(xì)胞活性顯著低于對(duì)照組（P<0.05）但仍有細(xì)胞活性。

圖5 不同DPI濃度對(duì)蠟樣芽孢桿菌活力和細(xì)胞活力的影響Fig.5 Effect of different DPI concentration on vigor and viability of Bacillus cereus

由圖6可知，當(dāng)DPI濃度≤1 μmol/L時(shí)，隨著DPI濃度的升高，平均菌膜形成量均高于對(duì)照組平均菌膜水平（P<0.05）。其中，0.1 μmol/L DPI處理組及1 μmol/L DPI處理組平均菌膜形成量最高，顯著高于0.05 μmol/L DPI處理組及0.5 μmol/L DPI平均菌膜形成量（P<0.05）。0.1 μmol/L DPI處理時(shí)，N6、L9、L12菌株形成較強(qiáng)菌膜；1 μmol/L DPI處理時(shí)，N6菌株形成較強(qiáng)菌膜，其他菌株均形成中等菌膜；0.05 μmol/L DPI處理時(shí)，Y34菌株形成較弱菌膜，其他菌株均形成中等菌膜；0.5 μmol/L DPI處理時(shí)，BC、Y34、L24菌株形成較弱菌膜，其他菌株均形成中等菌膜。

當(dāng)DPI濃度>5 μmol/L 時(shí)，隨著DPI濃度的升高，平均菌膜形成量低于對(duì)照組平均菌膜水平（P<0.05）。5 μmol/L DPI處理組平均菌膜形成量顯著高于10 μmol/L DPI處理組平均菌膜形成量（P<0.05）。5 μmol/L DPI處理時(shí)， N6、Y10、L9、L12菌株形成中等菌膜，其他菌株均形成較弱菌膜；10 μmol/L DPI處理時(shí)，N6、L9、L12菌株形成中等菌膜，其他菌株均形成較弱菌膜；對(duì)照組N2、N6、Y10、L9、L12菌株形成中等菌膜，其他菌株BC、Y22、Y34、L6、L8、L24形成較弱菌膜。

由圖6 ROS變化趨勢(shì)可知，隨著DPI濃度的升高，ROS的產(chǎn)生水平呈U型趨勢(shì)。這是因?yàn)镈PI是一種NADPH氧化酶抑制劑，抑制ROS產(chǎn)生，當(dāng)DPI濃度≤1 μmol/L時(shí)，隨著DPI濃度的升高，ROS逐漸下降；當(dāng)DPI濃度>5 μmol/L時(shí)，隨著DPI濃度的升高，ROS含量升高。結(jié)果表明：ROS產(chǎn)生和菌膜形成的趨勢(shì)相反，即低濃度DPI處理伴隨ROS的降低，Bacillus cereus菌膜形成量的增加，高濃度DPI處理伴隨ROS含量的升高，Bacillus cereus菌膜形成量的減少，因此，Bacillus cereus菌膜形成與ROS的減少相關(guān)。

圖6 不同DPI濃度對(duì)蠟樣芽孢桿菌ROS產(chǎn)生及菌膜形成的影響Fig.6 Effect of different DPI concentration on ROS production and biofilms formation of Bacillus cereus

2.4 激光共聚焦顯微鏡測(cè)定菌膜形成

由圖7A可知，0.01 μmol/L H2O2、1 μmol/L H2O2、100 μmol/L H2O2處理組與對(duì)照組相比具有更強(qiáng)的染色效果，菌膜呈現(xiàn)紅色的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而未經(jīng)處理組（對(duì)照組）呈現(xiàn)松散的結(jié)構(gòu)和更少的菌膜生物量，與圖2定量菌膜形成結(jié)果一致。由圖7B可知，NAC各處理組與對(duì)照組相比具有更強(qiáng)的染色，各處理組菌膜呈現(xiàn)紅色的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而對(duì)照組顯示松散的結(jié)構(gòu)和較少的菌膜生物量，與圖4定量菌膜形成結(jié)果一致。由圖7C可知，低濃度各處理組（DPI≤1 μmol/L）與對(duì)照相比具有更亮的染色，呈現(xiàn)紅色的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，高濃度處理組（DPI>5 μmol/L）隨著DPI濃度的升高，紅色信號(hào)越來(lái)越弱，當(dāng)10 μmol/L DPI濃度處理時(shí)，視野中紅色信號(hào)極少，表明低濃度的DPI處理對(duì)Bacillus cereus菌膜形成起促進(jìn)作用，高濃度DPI處理對(duì)Bacillus cereus菌膜形成起抑制作用，與圖6定量菌膜形成結(jié)果一致。因此，綜合以上結(jié)果，本研究得到Bacillus cereus菌膜形成與ROS減少相關(guān)的結(jié)論，這與HAJ等[24]發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌膜的形成依賴(lài)于ROS誘導(dǎo)量減少有關(guān)的研究結(jié)果一致。

圖7 共聚焦顯微鏡下觀察不同濃度（H2O2、NAC、DPI）對(duì)蠟樣芽孢桿菌菌膜形成的影響Fig.7 Effect of different concentrations (H2O2, NAC, DPI) on the formation of Bacillus cereus biofilms observedunder confocal microscope

3 結(jié)論與討論

ROS包括羥基自由基（OH）、原子氧（O）、過(guò)氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧（1O2）和臭氧（O3）等，ROS的累積超過(guò)允許水平會(huì)對(duì)各種大分子（DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)）造成損害，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[25]，ROS在生物體中的作用不是單一的、絕對(duì)的，細(xì)菌往往會(huì)通過(guò)某些途徑主動(dòng)生成較低水平的ROS，這些ROS在細(xì)菌中起到信號(hào)或是調(diào)節(jié)的作用，激發(fā)細(xì)菌某些特殊機(jī)制，如進(jìn)入防御狀態(tài)、輔助細(xì)菌入侵宿主細(xì)胞、抑制環(huán)境中其他競(jìng)爭(zhēng)者等[26]。CAP等[27]研究發(fā)現(xiàn)一定水平的ROS誘導(dǎo)會(huì)保護(hù)機(jī)體免受壓力機(jī)制，引起菌體對(duì)壓力適應(yīng)性反應(yīng)，ROS可能是作為誘導(dǎo)細(xì)菌群落分化和信號(hào)傳遞的信號(hào)分子，ROS誘導(dǎo)遺傳變異促進(jìn)特定菌膜區(qū)域的細(xì)胞死亡，以部分細(xì)胞的死亡增加同一群體中其他細(xì)胞的存活。

因此，ROS作為一種信號(hào)分子，探究其在細(xì)菌及其菌膜形成中的具體作用，有利于研發(fā)新型高效的抑菌劑和殺菌劑。本研究從不同奶源Bacillus cereus分離株的菌膜形成分析入手，以一定濃度的H2O2、NAC、DPI處理待測(cè)菌株，采用96孔結(jié)晶紫定量測(cè)定及激光共聚焦顯微鏡觀察菌膜形成情況，實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了細(xì)菌細(xì)胞活力，以排除試劑對(duì)細(xì)菌活性的影響，發(fā)現(xiàn)ROS是Bacillus cereus菌膜形成的潛在信號(hào)分子，隨著ROS的減少，Bacillus cereus菌膜形成量增加。在未來(lái)的研究中，還需進(jìn)一步剖析外源ROS和內(nèi)源ROS在調(diào)節(jié)菌膜形成中是否發(fā)揮不同的作用，并檢測(cè)可疑NADPH氧化酶的敲除和過(guò)表達(dá)是否改變Bacillus cereus的ROS產(chǎn)生和菌膜形成，這將有助于理解Bacillus cereus與ROS相關(guān)的菌膜形成機(jī)制。