沈雨婷，栗紹文，孟憲榮

（華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖北 武漢 430070）

WHO估算每年將近6億人因食用被污染的食品而生病，造成約42萬人死亡，其中，引起食品污染的主要微生物是彎曲菌（Campylobacter）、沙門菌（Salmonella）和腸出血性大腸埃希菌（EnterohaemorrhagicEscherichia coli, EHEC）等致病菌[1]。食源性疾病的暴發(fā)促使研究人員尋找更快捷有效的方法來監(jiān)控食品中的微生物。隨著計算機技術的發(fā)展，ROBERTS等[2]提出“預測微生物學”這一概念，通過開發(fā)相應的數(shù)學模型可預測食品從原材料到食用過程中每個階段微生物的行為，解決食源性疾病暴發(fā)下檢測手段不足的問題。構(gòu)建正確的預測模型可為食品安全決策者提供準確且快速的微生物信息，有效地開展微生物定量風險評估[3]、貨架期估算[4]等生產(chǎn)活動。

現(xiàn)在主要的分類方式由WHITING等[5]建立，按照變量類別分為一級模型、二級模型和三級模型。二級模型則是描述微生物生長參數(shù)（最大生長速率μmax、延滯時間λ）與環(huán)境參數(shù)（溫度、pH等）之間的關系?，F(xiàn)在研究過程中使用較多的二級模型是平方根模型[6?7]，其僅考慮為溫度這一環(huán)境變量。為了面對更為復雜多樣的食品環(huán)境，如核心參數(shù)模型（cardinal parameters model，CPM）[8]和響應面模型（response surface model）[9]等定量描述多環(huán)境因素對生長參數(shù)影響的模型將會被更廣泛地應用到研究和實踐中。核心參數(shù)模型的優(yōu)點是其容易獲得參數(shù)的初始值且參數(shù)具有明確生物學意義、類型廣泛，因而逐漸成為研究預測微生物學的重要工具[10?12]。

本文首先介紹了核心參數(shù)模型的概念以及現(xiàn)階段國內(nèi)外使用最廣的核心參數(shù)模型。然后介紹了核心參數(shù)模型的擴展和優(yōu)化情況以及其在食品安全領域的應用，最后對未來的研究方向進行了展望，以期為預測微生物學的相關研究提供參考。

1 核心參數(shù)模型

核心參數(shù)模型是預測微生物模型中的一種二級模型，最早由ROSSO等[8]提出基于溫度的CPM（cardinal temperature model with inflection, CTMI），通過定義核心環(huán)境因素即溫度的參數(shù)（最大值、最小值和最適值）和最適條件時的最大生長速率來描述微生物生長速率和溫度的方程。隨后又提出了基于pH的CPM（cardinal pH model）[13]和基于水分活度（water activity，aw）的CPM[14]。ROSSO等[8]所建立的CPM相對于現(xiàn)在使用最頻繁的平方根模型的優(yōu)點在于其參數(shù)具有明確的生物學意義，并且隨著研究的深入開發(fā)了針對不同環(huán)境因素的模型，大大增強了適用范圍，成為研究食品生產(chǎn)、貯藏過程中微生物監(jiān)控技術的重要工具。

1.1 單因素的核心參數(shù)模型

Gamma概念（γconcept）[15?16]量化了環(huán)境因素對微生物生長速率的獨立影響，CPM則基于Gamma概念進一步發(fā)展，其中每個最佳生長條件的μmax（μopt）因與最佳生長條件不同的每個環(huán)境因素而降低。每個次優(yōu)環(huán)境因子的影響γ（X）都用一個介于0和1之間值的項來表示；當環(huán)境因素值在Xmin—Xmax的范圍之外時，γ（X）為0。

單因素的CPM公式[16]為：

式中，μmax為最大生長速率，lnCFU·（g·h）?1；μopt是最佳生長條件下的最大生長速率，lnCFU·（g·h）?1；γ（X）描述了環(huán)境因素X對微生物生長速率的相對影響。

γ（X）的類別多樣?，F(xiàn)階段使用較多的描述溫度、pH、aw的γ（X）公式具備拐點[17]（如式2）。

描述CO2的γ（[CO2]）較為簡單[17?18]，公式為：

式中，Xmax、Xmin、Xopt分別是微生物能夠生長的最大環(huán)境因素值、最小環(huán)境因素值以及最適環(huán)境因素值；n是形狀參數(shù)（溫度和aw的n為2；pH的n為1）。aw的Xmax一般設定為1；對真菌而言，當不存在CO2時真菌生長最佳，因此，CO2opt可以設置為0%[19]。

常用的平方根模型和Arrhenius模型[20?21]無法準確描述當溫度超過Topt時μmax降低這一現(xiàn)象；而從式（2）可以看出，CTMI并非單純地描述線性關系，其通過計算μopt和Topt，避免了因線性形式所產(chǎn)生的參數(shù)間結(jié)構(gòu)相關性等問題，有效增大了模型預測溫度的有效范圍[8,22]。

描述有機酸的γ（[HA]）則有所不同[23]，其抑制作用主要歸因于其未解離形式HA，未解離的酸能夠穿透細胞膜，降低細胞內(nèi)pH從而引起抑制作用。γ（[HA]）的公式如下：

式中，[HAU]、[HA]分別為未解離和初始有機酸的濃度（mmol/L）；MICUHA是未解離有機酸的最小抑菌濃度；pKa為酸解離常數(shù)；n1、n2是數(shù)學參數(shù)，為了最恰當?shù)拿枋鲎兓琻1被設置為0.5或1.0，n2被設置為1.0或2.0，設置值通過均方誤差確定，與有機酸的種類、微生物的類型有一定關系（見表1）[23]。

表1 在不同有機酸中單增李斯特菌和乳酸菌的γ（[HA]）所對應的n1、n2的值[23]Table 1 Values of n1 and n2 corresponding to γ ([HA]) of Listeria monocytogenes and lactic acid bacteria in different organic acids[23]

1.2 多因素的核心參數(shù)模型

多因素的CPM基于單因素的CPM，通過將各因素的γ（X）相乘來確定多個環(huán)境因素的組合效果。MARC等[24]引入互作效應因子ξ，從每個環(huán)境因素項中獲得φei，擴展了Gamma概念，以考慮環(huán)境因素之間相互作用的影響。例如溫度、pH和aw這類環(huán)境因素相對獨立，互作不明顯，ξ可設定為1[19]；而像有機酸的解離會受到溫度和pH的影響，需要考慮互作效應[24]。

以基于溫度、pH、有機酸的CPM[24]為例，公式如下：

式中，ξ為各因素的互作因子；φei是每個因素對相互作用的影響，根據(jù)ψ把生長狀態(tài)分為三個部分，（i）如果ψ≤閾值（θ），此時微生物生長且各環(huán)境因素之間不產(chǎn)生相互作用（ξ=1）；（ii）如果θ<ψ<1，微生物會生長，但由于各因素之間相互作用μmax減??；（iii）如果ψ≥1，微生物不生長（ξ=0），ψ=1為微生物的生長邊界。根據(jù)理論假設，θ設定為1/2。

2 核心參數(shù)模型的擴展及優(yōu)化

近年來，研究人員對核心參數(shù)模型進行擴展和優(yōu)化，以更加有效地監(jiān)控食品中的微生物，一是在已有模型的基礎上增加新的環(huán)境參數(shù)，特別是各種有機酸以及有機酸鹽等；二是對原有的模型因子進行優(yōu)化或者擴展。

在原有CPM的基礎上增加新的環(huán)境參數(shù)，可以使模型更加完善，應對復雜的食品環(huán)境。GIMéNEZ等[25]比較已建立的模型，通過合并這些模型獲得了描述苯酚、溫度、aw、pH、乳酸、亞硝酸鹽的核心參數(shù)模型。在此之后，研究人員又陸續(xù)研究了包括CO2、雙乙酸鹽等環(huán)境因素的γ函數(shù)并將其添加到已有的模型上[25?32]，表2簡單地展示了與CPM擴展有關的研究。例如通過不斷地擴展，MEJLHOLM等建立的模型（2009）[28]包含了12個環(huán)境因素及其交互作用，并且通過Ψ值量化生長邊界與特定產(chǎn)品特征之間的距離。MEJLHOLM等[29]證實了只要模型的復雜性與產(chǎn)品的復雜性相匹配（即所有重要的環(huán)境參數(shù)都應包括在模型中），一個預測模型就足以準確預測乳酸桿菌（Lactobacillusspp.）的生長。除此以外，他們還發(fā)現(xiàn)盡管新模型并不適用于其它細菌，如肉桿菌（Carnobacteriumspp.）、明串珠菌（Leuconostocspp.）、魏斯菌（Weissellaspp.），但它可以幫助了解關于其他細菌與乳酸桿菌的生長特性的信息，從而提供這些細菌的潛在腐敗域[29]。KOUKOU等[32]建立的模型對研究中未涉及的奶制品也有良好的預測。上述擴展以單增李斯特菌等細菌為對象的CPM時所運用的方法可為建立其他微生物的多因素CPM提供有效參考。

表2 核心參數(shù)模型在食品環(huán)境參數(shù)上的擴展Table 2 Extension of the cardinal parameters models on food environmental parameters

微生物的生物學特性各不相同，因而相同環(huán)境下它們表現(xiàn)的生長狀態(tài)也各有差異。例如BAJARD等[33]發(fā)現(xiàn)某些李斯特菌菌株的μmax的平方根與溫度在次優(yōu)范圍內(nèi)并不呈線性關系，在10～15 ℃之間存在一變化溫度（change temperature），低于此溫度時單增李斯特菌的生長速率快于預期。因此，MARC等[24]針對李斯特菌的CTMI進行了調(diào)整，在基本溫度（Tmin，Topt，Tmax）的基礎上增加兩個附加參數(shù)Tc、T1，獲得的aCTMI能更好地預測較低溫度下的生長速率（見式12）。同時也有研究證明aCTMI在預測大腸埃希菌K12 MG1655的生長速率優(yōu)于CTMI和平方根模型[34]。

式中，Tc為變化溫度（℃），將模型分為兩個部分，在其上下使用不同的數(shù)學表達式；T1為第一個線性部分和橫坐標直線之間的交點（℃）[24]。

針對pH的CPM展開的改造也非常多樣化。有研究表明pH的下降只引起相對較小的生長速度下降，只有當接近極限pH時，生長速率會發(fā)生明顯下降，而式（2）表示的γ（pH）則接近于對稱的拋物線曲線[13]。為了解決這一問題，通過在原有的γ（pH）上進行開方處理（見式13），從而使模型在pHopt周邊的變化更趨于和緩；而針對在次優(yōu)和超優(yōu)pH范圍內(nèi)pH值變化的反應在結(jié)構(gòu)上存在不同的情況，則進一步將“pH-pHmin”改為“（pH-pHmin）η”（見式14），通過添加參數(shù)使得CPM更容易調(diào)整到最優(yōu)狀態(tài)[35]。

式中，κ、η為數(shù)學參數(shù)，κ≥1。

除此以外，MEJLHOLM 等[27]建立的模型（2009）僅適用于pH>5.4的環(huán)境，而單增李斯特菌在pH<5.4時依然可以生長[36]。為了彌補這一缺陷，MARTINEZRIOS等[37]通過試驗和文獻數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)pHmin與溫度存在數(shù)量關系，因而建立了基于溫度的pHmin函數(shù)（見式15），并用其代替了原模型中恒定的pHmin，建立了新的CPM。驗證結(jié)果顯示其成功地將適用范圍擴展到pH>4.6，從而提高對單增李斯特菌在低pH食品中生長的預測準確性。

式中，TR是與最小的pHmin相對應的溫度（℃）；pHminR是TR時的pHmin，T是儲存溫度（℃）；pHminR、pHminT、pHmin0和pHmin37分別為TR、T、0 ℃和37 ℃時的pHmin。

通過對γ（X）進行優(yōu)化和修正，CPM能夠更準確地預測并監(jiān)控微生物的生長情況，同時這也對研究人員提出了更高的數(shù)學素養(yǎng)要求，需進一步推進學科間的交互。

3 核心參數(shù)模型在食品安全領域的應用

預測食品微生物學模型可以量化微生物對食品的理化特性的響應，預測在預期和惡劣的儲存條件下的潛在增長，促進微生物食品安全性的評估和管理。核心參數(shù)模型通過與其他預測模型聯(lián)用，尤其是一級模型以及生長概率模型[38?39]，以更好地發(fā)揮作用，展現(xiàn)了模型間使用的聯(lián)動性。

一方面，CPM可以確定主要的環(huán)境因素（如溫度、pH、aw）對微生物生長的影響，從而開展食品的風險評估以及為食品保存提供參考（見表3）。董慶利等[40]在模型基礎上根據(jù)食品安全目標（food safety objective，F(xiàn)SO）定性分析生熟食品中單增李斯特菌在不同材質(zhì)的案板上交叉污染水平并進行風險等級排序，結(jié)果表明對案板不進行任何清洗處理時最易引發(fā)交叉污染，木質(zhì)案板相較于塑料和不銹鋼的風險更大。BELBAHI等[19]的研究結(jié)果顯示aw和CO2的組合顯著影響了黑曲霉（Aspergillus niger）和鏈格孢菌（Alternaria alternata）的生長，開發(fā)的模型為選擇棗類水果保存方式（即冷藏、干燥、改良的大氣包裝或其組合）提供了決策支持。KAKAGIANNI等[41]模擬食品在交付給消費者之前的運輸、分配和儲存的各個過程，從而評估在等溫和非等溫條件下細菌生長情況，用于食品安全的有效風險管理。DALGAARD等[23]則是將CPM和交互模型[42]聯(lián)用，建立的單增李斯特菌生長和生長邊界模型被納入食品腐敗和安全預測軟件（food spoilage and safety predictor software，F(xiàn)SSP）以更好地開展實際應用。

表3 核心參數(shù)模型在食品風險管理中的應用Table 3 Application of the cardinal parameters models in food risk management

另一方面，CPM還可對食品抑菌劑的效果進行評價，確定合適的抑菌劑使用量，同時也有助于開發(fā)新的抑菌劑，例如乙酸、檸檬酸等有機酸已作為食品的抑菌劑被美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）確定為一般公認安全（gernerally recognized as safe，GRAS）添加劑[50]。有研究表明乳酸鈉（NaL）可作為防腐劑顯著抑制銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的生長[51?52]，因此，董慶利等[53]將NaL整合到CPM之中，確定了NaL的最小抑制銅綠假單胞菌濃度。VALíK等[54]就通過CPM模擬了乳酸，苯甲酸鈉和溫度對麥芽假絲酵母生長的影響，研究發(fā)現(xiàn)乳酸濃度的增加可以延長延滯時間和降低生長速率以及苯甲酸鈉對酵母菌群的抑制作用隨溫度的變化而變化。MARTINEZ-RIOS等[31]則為將Nisin A作為抑菌劑添加到奶酪中的實際應用提供了參考。而MARTINEZ-RIOS等[37]為了探討葡萄糖酸（gluconic acid, GAC）對單增李斯特菌的抑制作用，在MEJLHOLM 等建立的模型（2009）[28]的基礎上增加了與GAC相關的γ函數(shù)，結(jié)果卻顯示其在預測奶酪中單增李斯特菌的性能時弱于原始模型。雖然模型的結(jié)果看起來增加的GAC函數(shù)是無用的，但這也說明奶酪中單增李斯特菌的生長抑制可能是通過食品的pH等其他因素的綜合作用導致的，而不是通過GAC發(fā)揮作用。因而CPM也可用于排除無效的抑制因素。

除原有的預測微生物模型應用外，核心參數(shù)模型也逐漸應用到其他方面。例如，以往有關細菌生物被膜的研究多為定性[55?57]，研究人員開始利用CPM定量評估環(huán)境因素對生物被膜形成的影響，展現(xiàn)了模型使用的廣泛性。DIMAKOPOULOU-PAPAZOGLOU等[11]建立了評估pH和aw對新港沙門菌（S. newport）的生物被膜形成能力的CPM和概率模型，發(fā)現(xiàn)允許沙門菌形成生物被膜的pH和aw的范圍比允許細菌生長的范圍更大。TANGO等[58]開發(fā)了評估pH、乙醇濃度和aw對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的生物被膜形成能力的CPM。盡管上述模型基于簡化的生長介質(zhì)（液體培養(yǎng)基）以及間接測定（光密度）形成的生物被膜，但開發(fā)的模型為量化影響生物被膜多種環(huán)境因素的整體相互作用奠定了良好的基礎，并且可以為控制生物被膜提供有用的信息。對于生物被膜建模方法的發(fā)展具有重大價值，包括開發(fā)直接定量生物被膜的方法，基于實驗室基質(zhì)的食品基質(zhì)和食品相關環(huán)境（食品接觸表面）中模型的預測能力的評估和驗證，其他環(huán)境因素（例如溫度、抑菌劑等）對生物被膜形成影響的描述，以及在生物被膜形成模型中納入變異性。

CPM也開始用于研究其他單細胞生物的生長情況。例如在成功優(yōu)化微綠球藻在濁靜操作下的穩(wěn)態(tài)生物量生產(chǎn)力的基礎上[59]，WEISE等[60]利用動態(tài)的粗粒度模型和CTMI來描述不連續(xù)操作過程中中試規(guī)模的管狀光生物反應器內(nèi)與光和溫度有關的特定微藻的生長速率，以最終預測生物量的增長并且根據(jù)模型的反饋結(jié)果優(yōu)化了工藝參數(shù)，明顯提高了生產(chǎn)率，為轉(zhuǎn)移至更大規(guī)模的管狀光生物反應器提供了參考。上述的研究為CPM乃至預測微生物在食品安全以及生產(chǎn)中的應用提供了新的可能。

4 小結(jié)

描述多環(huán)境因素的核心參數(shù)模型可以應對復雜的食品環(huán)境，有其研究和發(fā)展的必要性。國外自20世紀90年代起對CPM的研究逐漸增多，其研究對象不僅包括單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等食源性致病菌，還包括黑曲霉菌等腐敗真菌?？蒲腥藛T通過增加新的環(huán)境參數(shù)γ函數(shù)以及對原有的模型因子進行優(yōu)化或擴展來有效地提高CPM的準確性，但國內(nèi)與此相關的研究仍較少。CPM考慮了各種食品特性和存儲條件的影響以及這些環(huán)境因素的影響，然后通過模型預測并監(jiān)控食品環(huán)境中的微生物，從而確定食品的安全性，使開發(fā)或重新制定安全食品配方（例如改變的pH和有機酸濃度）變得更加容易和快捷。與此同時，CPM的使用也日趨多元化。

為了使核心參數(shù)模型能夠更好地運用于實踐中，還有許多工作需要完善，對于CPM未來地研究方向展望如下：a.建立CPM需要大量的試驗數(shù)據(jù)，因而試驗負擔很大，需要思考簡便的試驗方法包括已經(jīng)發(fā)表的文獻數(shù)據(jù)來有效地縮短模型的研發(fā)時間；b.現(xiàn)在研究的CPM多以培養(yǎng)基為基礎，與實際的食品基質(zhì)存在一定區(qū)別，同時微生物的生物學特性各不相同，為了解決這類問題，CPM需要根據(jù)食品和微生物的種類進行調(diào)整，因此在發(fā)展過程中需更加多元化、專業(yè)化，使CPM更加緊密有效地應用到食品質(zhì)量和安全控制中去；c.將CPM與已有的微生物預測軟件結(jié)合，使非專業(yè)人員在食品監(jiān)控和研發(fā)過程中可以快速準確地了解并使用相關模型。