魏 超, 代曉航, 郭靈安, 劉 煒

(四川省農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心,四川成都 610066)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrixassisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)是一種軟電離質(zhì)譜,可以通過檢測微生物蛋白質(zhì)的特異性達到鑒定微生物的目的[1-2]。微生物蛋白質(zhì)體系主要受遺傳因素控制,受培養(yǎng)基組份、培養(yǎng)時間以及培養(yǎng)條件等外部因素影響較小,所以微生物蛋白具有穩(wěn)定性和特異性[3]。MALDI-TOF MS采用基質(zhì)解析電離的方式獲得微生物特異性蛋白質(zhì)指紋圖譜,對圖譜中蛋白質(zhì)標識峰信息與標準數(shù)據(jù)庫進行多重比較達到對微生物鑒定的目的,因此MALDI-TOF MS在微生物檢測上可以獲得更多微生物的信息[4]。國外已經(jīng)將MALDI-TOF MS方法用于人類致病菌的快速檢測鑒定中[5-6]。草莓為薔薇科多年生草本植物,在園藝學上將其劃分為漿果類,是當今消費量十大水果之一[7]。草莓食用肉質(zhì)部分為花托發(fā)育,可食用部分占98%,高含糖量、高含水量的特點使其成為微生物的天然培養(yǎng)基,且草莓表面凸凹,存在微觀疏水區(qū),大部分清洗方法無法將果蔬表面的微生物徹底清除[8],微生物的大量附著且較難清洗干凈增加了其食用風險。在歐盟HACCP體系中草莓表面致病微生物的監(jiān)測是其關(guān)鍵控制點,國際食品法典對多種生食果蔬微生物的檢測方法及限量進行了規(guī)定,速凍草莓相關(guān)檢測也在其中,且鮮果草莓微生物檢測也進入國際標準化優(yōu)先名錄[9]。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)為條件致病菌,可引成人及免疫力低下嬰幼兒起嘔吐、腹瀉、頭痛等癥狀[10],且極易產(chǎn)生耐藥性,是人和動物常見的感染菌[10-13]。此菌生長溫度范圍較寬,該菌具有4℃不生長而在42℃可以生長的特點[9],這一特點可以用來對其進行選擇性培養(yǎng)。黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)屬于腸桿菌科沙雷屬,一般見于水、土壤、腐爛的蔬菜、肉和淀粉豐富的食品上,是住院病人重要條件致病菌[10],可引起敗血癥和尿道感染[14-15],黏質(zhì)沙雷氏菌在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上可以產(chǎn)生靈菌紅素(prodigiosin)和吡羧酸(pyrimine)兩種不同的色素,最適的生長溫度37～40℃、NaCl水溶液質(zhì)量濃度0～7 g/L[13]。本實驗根據(jù)兩種微生物的特性設(shè)計分離方法,采用MALDI-TOF MS對分離的黏質(zhì)沙雷氏菌和銅綠假單胞菌進行鑒定和蛋白質(zhì)圖譜特異性篩選,旨在對草莓的食用風險分析、衛(wèi)生事件溯源及農(nóng)產(chǎn)品微生物檢測方法優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草莓50份,基地樣品25份,采自成都的新津、大邑、雙流、郫縣、天府新區(qū)25個草莓基地;超市及菜市場樣品25份,采自成都5個超市和8個菜市場,抽樣方式離散型隨機分布,基本覆蓋成都城區(qū)。

緩沖蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)、營養(yǎng)瓊脂、銅綠假單胞菌桿菌顯色培養(yǎng)基、四硫磺酸鹽煌綠增菌培養(yǎng)基(tatrathionate broth,TTB),北京陸橋生物技術(shù)有限公司;乙腈、乙醇,均為色譜純,美國Fisher Scientific公司;甲酸,色譜純,美國Tedia公司;α-氰基-4-羥基肉桂酸(2-cyano-3-(4-hydroxyphenyl)-2-propenoic acid,CHCA),美國Sigma公司;實驗用水均為去離子水;生理鹽水、ID 32 E腸桿菌科微生物鑒定試劑條,生物梅里埃公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AXIMA Confidence型 MALDI-TOF MS儀,日本島津公司;ATB微生物鑒定儀、比濁儀,生物梅里埃公司;DHP 9082型生化培養(yǎng)箱,寧波東南生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 銅綠假單胞菌與黏質(zhì)沙雷氏菌的分離

銅綠假單胞菌分離：稱取25 g樣品,225 mL BPW均質(zhì)后36℃培養(yǎng)18 h,取1 mL BPW增菌液于TTB中42℃選擇性增菌培養(yǎng)24 h,增菌液劃線于銅綠假單胞菌顯色平板36℃培養(yǎng)24 h,選取表現(xiàn)陽性菌劃線于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,36℃培養(yǎng)24 h后進行質(zhì)譜鑒定和生化鑒定。

黏質(zhì)沙雷氏菌分離：稱取25 g樣品于225 mL無菌水中均質(zhì),40℃培養(yǎng)16 h,取0.25 mL涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,38℃培養(yǎng)24 h,對紅色或粉色菌落進行營養(yǎng)瓊脂純化,36℃培養(yǎng)24 h后進行質(zhì)譜鑒定和生化鑒定。

1.3.2 微生物的生化鑒定

挑取1.3.1節(jié)純化單菌落至生理鹽水比濁管中,在比濁儀調(diào)至0.5麥氏濁度(梅里埃標準管校正),用移液器移取55μL至ID 32 E試劑條樣杯中,36℃培養(yǎng)24 h后由ATB微生物檢定儀讀出鑒定結(jié)果。

1.3.3 MALDI-TOF MS鑒定與相關(guān)分析

用10μL接種環(huán)取2個單菌落菌量加入1.0 mL φ(乙醇)=70%的水溶液φ(乙醇)=70%的溶液中,震蕩30 s,離心1 min棄上清液,加入φ(乙醇)=75%的水溶液75μL震蕩20 s,常溫40 kHz超聲10 min,加入75μL乙腈震蕩均勻,離心1 min取上清液1μL點至靶板,加入1μL CHCA,晾干。

質(zhì)譜條件：檢測器線性模式 電子倍增管(multiple dynode),MALDI離子源,正離子模式固定聚焦337 nm,激光束能頻75～80 Hz,收集范圍m/z 2 000～20 000 u,每樣品收集200次峰疊加,校準品為ATCC 8739大腸桿菌。

數(shù)據(jù)分析：收集質(zhì)譜圖譜導入MALDI SARAMIS微生物鑒定系統(tǒng)中指紋數(shù)據(jù)庫與數(shù)據(jù)庫的標準譜圖進行多重比較,采用SARAMIS Premium軟件中的Superpectrum和Taxonomy的進行標記峰足跡圖繪制、標識峰整理與微生物聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠假單胞菌和黏質(zhì)沙雷氏菌的分離與鑒定

在50個草莓樣品中9份樣品分離到銅綠假單胞菌,檢出率為18%;10份樣品中檢測出黏質(zhì)沙雷氏菌,檢出率20%。生化鑒定結(jié)果見表1,質(zhì)譜見圖1,質(zhì)譜鑒定結(jié)果與生化鑒定結(jié)果一致,可以驗證質(zhì)譜鑒定準確性。實驗結(jié)果顯示銅綠假單胞菌和黏質(zhì)沙雷氏菌在草莓中檢出率較高,且檢出結(jié)果僅與草莓成熟程度有關(guān),與樣品取樣地點無關(guān),表明這兩種條件致病菌是草莓表面的常見微生物。

2.2 銅綠假單胞菌的MALDI-TOF MS相關(guān)分析

9份草莓中分離的銅綠假單胞菌的質(zhì)譜足跡圖顯示小分子量區(qū)域的標識峰較密集,隨著分子量增大,識別標識峰逐漸減少。分離的銅綠假單胞菌足跡圖表明,鑒定同為一種菌,同種處理方法下標識峰數(shù)目和軌跡仍差異較大。對9份銅綠假單胞菌的所有標識峰進行擬合運算,mi(1±0.08%)內(nèi)被認定為同個標識峰,銅綠假單胞菌共有標識峰12組見圖2,認定為草莓銅綠假單胞菌的特征標識峰。

表1 銅綠假單胞菌和黏質(zhì)沙雷氏菌生化鑒定結(jié)果Tab.1 Biochemistry map of Pseudomonas aeruginosa and Serratia marcescens in strawberry

圖1 微生物鑒定質(zhì)譜Fig.1 Microorganism masspectrum of MALDI-TOF MS

對分離的銅綠假單胞菌標識峰進行聚類分析,分析圖譜見圖3a,以標識峰為測量點在用馬氏算法計算微生物之間的距離時,默認權(quán)重Wi(i=1,2,3…p),為標識峰分子量的倒數(shù),對12組特征峰進權(quán)重W乘以自然常數(shù)e以增加權(quán)重,重新計算聚類分析圖譜見圖3b,由圖可以看出對特征峰進行加權(quán)后樣品間的相關(guān)位置有一定變化,相關(guān)系數(shù)有所提高,但一級分支位置基本沒變,4號和9號相關(guān)系數(shù)最高,表明兩株銅綠假單胞菌種間差異小,經(jīng)調(diào)查2份樣品來自基地,且基地位置毗鄰。

圖2 銅綠假單胞菌特征標識峰質(zhì)譜Fig.2 Pseudomonas aeruginosa characteristic peaks of MALDI-TOF MSmass spectrum

圖3 銅綠假單胞菌MALDI-TOF MS聚類分析Fig.3 Pseudomonas aeruginosa cluster dendrogram by MALDI-TOF MS

2.3 黏質(zhì)沙雷氏菌的MALDI-TOF MS相關(guān)分析

圖4 黏質(zhì)沙雷氏菌特征標識峰質(zhì)譜Fig.4 Serratia marcescens characteristic peaks of MALDI-TOF MS

草莓分離的黏質(zhì)沙雷氏菌的質(zhì)譜圖見圖1b,對分離10份樣品黏質(zhì)沙雷氏菌進行全標識峰擬合運算,同株標識峰范圍為mi(1±0.08%),10株黏質(zhì)沙雷氏菌共有8組完全擬合的特征峰(見圖4),對分離的10株黏質(zhì)沙雷氏菌進行全標識峰進行聚類分析,見圖5a,其中5號和10號、6號和9號、1號和8號黏質(zhì)沙雷氏菌在一級分支中,但其相關(guān)系數(shù)均小于60%,對特征峰進行加權(quán)后重新聚類,見圖5b,聚類結(jié)果可見一級分支中6號和2號黏質(zhì)沙雷氏菌的相關(guān)位置發(fā)生改變,且相關(guān)系數(shù)提高到大于90%,其余一級分支的相關(guān)系數(shù)也有提高,經(jīng)溯源6號和2號分離草莓來自同一市場不同攤位,1號和8號分離草莓樣品為毗鄰基地樣品?？梢奙ALDI-TOF MS可以用來微生物的溯源和種間特征性分析,但若提高其準確性,還需要進一步優(yōu)化數(shù)據(jù)庫。

圖5 黏質(zhì)沙雷氏菌聚類分析樹狀圖Fig.5 Serratia marcescens cluster dendrogram by MALDI-TOF MS

3 結(jié) 論

草莓中微生物群落較多樣[16-17],銅綠假單胞菌分離方法的設(shè)計是根據(jù)銅綠假單胞菌42℃可以生長的特點,其中連四硫磺酸陰離子可抑制大腸菌群,且顯色培養(yǎng)基可以分辨銅綠假單胞菌,該分離方法對草莓中銅綠假單胞菌有較好的分離效果;黏質(zhì)沙雷氏菌分離方法設(shè)計是根據(jù)沙雷氏菌對營養(yǎng)要求低,可以在水中生存營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)色素的特點設(shè)計,實驗中分離多種沙雷氏菌,經(jīng)質(zhì)譜鑒定黏質(zhì)沙雷氏菌的檢出率最高。

MALDI-TOF MS對草莓中純化的微生物有很好的識別率,經(jīng)生化試驗驗證,鑒定完全一致,但質(zhì)譜圖譜給予微生物蛋白質(zhì)的信息量較高,可用于溯源分析等相關(guān)應(yīng)用,但提高其準確性還需要進一步優(yōu)化數(shù)據(jù)庫。MALDI-TOF MS為開放平臺,可對于農(nóng)產(chǎn)品中復雜且有一定特性的微生物種類進行記錄,尋找其中特征性規(guī)律,便于對農(nóng)產(chǎn)品微生物進行監(jiān)測和研究。