韓興林，劉建華，栗 偉，程相國，陳 彬，胡景輝

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京100015；2.黑龍江北大倉集團(tuán)有限公司，黑龍江齊齊哈爾161005；3.黑龍江省輕工科學(xué)研究院，黑龍江哈爾濱150010；4.中糧黑龍江釀酒有限公司，黑龍江肇東152000）

中國的白酒，是以糧食谷物為主要原料，以大曲、小曲、麩曲或者酒母等為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、發(fā)酵、蒸餾而制成的蒸餾酒[1-3]。作為傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的中國白酒具有特色鮮明的產(chǎn)品屬性和文化屬性，除了飲用之外，更具有豐富獨(dú)特的精神文化魅力[4-5]。而醬香型白酒更是其中的佼佼者，其工藝復(fù)雜繁瑣，以醬香突出、幽雅細(xì)膩，入口柔綿醇厚，回味悠長著稱，以高粱、小麥為原料，以小麥踩制之中高溫大曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫流酒、長期貯存、精心勾兌而成[6-8]。

醬香型白酒中的酒曲、酒醅、窖泥中含有大量的微生物，而這些微生物，特別是一些功能微生物對醬香型白酒的品質(zhì)起到至關(guān)重要的作用[9-11]。例如謝和等[12]以醬香白酒的大曲出發(fā)，經(jīng)過分離純化得到8株產(chǎn)醬香菌株，經(jīng)過研究得出這些菌株為芽孢桿菌。莊名揚(yáng)等[13]從醬香酒曲中分離到1株利于酒體香氣形成的菌株，經(jīng)過鑒定為地衣芽孢桿菌。張榮等[14]從大曲中篩選得到3株菌株，均產(chǎn)醬香，經(jīng)過分子鑒定確定為地衣芽孢桿菌。而在其他香型白酒中，功能微生物也對酒體起到重要作用，例如劉桂君等[15]從清香酒曲中篩選得到地衣芽孢桿菌，并將其添加到酒醅中發(fā)酵產(chǎn)二鍋頭基酒，其中乙酸乙酯含量明顯提高。不僅如此，該基酒中的乳酸乙酯含量降低，酒體還十分協(xié)調(diào)、自然。王麗等[16]研究了汾酒大曲，篩選得到42株菌株，經(jīng)過篩選得到1株耐高溫蛋白酶活性較高的菌株。

因此將一些功能微生物合理的應(yīng)用到正常白酒釀造生產(chǎn)中，將會改善白酒的口感，提高其品質(zhì)。本研究將功能微生物應(yīng)用至醬香型白酒，并取得了良好的效果，提高了白酒品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗室保藏菌種：細(xì)菌BX01—BX08，酵母BF01—BF03、BZ01—BZ03。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗室酒醅最佳發(fā)酵溫度及時間的測定

取入窖酒醅，在不同溫度（25℃、30℃、35℃）下培養(yǎng)發(fā)酵不同時間（7 d、14 d、21 d）后，取100 g酒醅蒸餾100 mL酒樣，測定溜出液的酒精度、總酸含量、總酯含量，每個條件做3個平行，以確定實驗室酒醅最佳發(fā)酵溫度及時間。

1.2.2 混合細(xì)菌菌株的實驗室發(fā)酵實驗

（1）細(xì)菌間相互抑制作用

將功能菌庫中的細(xì)菌BX01—BX08，兩兩配對，點接于酪素平板上，使其間距在1.5～2.5 mm之間，以37℃培養(yǎng)24 h、48 h后，觀察記錄其生長情況。

（2）混合細(xì)菌強(qiáng)化實驗室酒醅發(fā)酵

制備單株細(xì)菌液，按要求分別混合3種細(xì)菌液為1組，共26組，每組2個平行，總接種量為7.5%的強(qiáng)化實驗室發(fā)酵酒醅，35℃下培養(yǎng)發(fā)酵21 d后，取酒醅蒸餾，測定酒精度，總酸、總酯含量。

（3）強(qiáng)化酒醅餾出液中四甲基吡嗪含量測定將酒樣先用酒精浸提后濃縮，頂空固相微萃取后，進(jìn)入氣相色譜測定四甲基吡嗪含量。

1.2.3 混合酵母菌株的實驗室發(fā)酵實驗

將發(fā)酵酵母BF01—BF03分別與產(chǎn)酯酵母BZ01—BZ03兩兩組合強(qiáng)化酒醅，分別制備酵母菌液，總接種量10%，以35℃發(fā)酵21 d，蒸餾酒醅，測定其酒精度，總酸、總酯含量，60%色譜純酒精稀釋10倍后，進(jìn)行色譜測定。

1.2.4 混合細(xì)菌菌株的入窖生產(chǎn)實驗

將BX01—BX03分別經(jīng)過三級培養(yǎng)后強(qiáng)化酒醅，細(xì)菌總數(shù)109個/mL，混合后總接種量為窖池總料的3‰，接種方式：直接入窖與堆積入窖，以同一排次另一窖池作對照組，出窖蒸酒單獨(dú)保存，貯存一段時間后，測定其酒液各項指標(biāo)。

1.2.5 混合酵母菌株的入窖生產(chǎn)實驗

將BF01、BZ03分別經(jīng)過三級培養(yǎng)后強(qiáng)化酒醅，酵母總數(shù)達(dá)108個/mL，混合液體接種，總接種量為窖池總料的3‰，直接拌酒醅入窖，以同一排次另一窖池作對照組，出窖蒸酒單獨(dú)保存，貯存一段時間后，測定其酒液各項指標(biāo)。

1.3 試驗窖池

28個生產(chǎn)窖池，磚地泥窖，窖齡均在40年以上，窖池長3.6 m，寬3 m，深4 m，每個窖池料醅量約為17.5 t。從1#—28#中隨機(jī)挑選9個窖池作生產(chǎn)應(yīng)用試驗窖池，分別為 2#、5#、8#、10#、13#、17#、20#、23#、27#，其中 5#、17#、23#窖池做混合酵母菌株強(qiáng)化入窖酒醅實驗，2#、8#、20#窖池做混合細(xì)菌菌株強(qiáng)化入窖酒醅實驗，10#、13#、23#做混合細(xì)菌菌株強(qiáng)化堆積酒醅實驗，強(qiáng)化第5排酒醅，蒸酒后單獨(dú)留樣保存，用余下的窖池做參照進(jìn)行對比。釀造醬香型白酒的6個排次結(jié)束后，計算每個窖池的原料出酒率（以65%vol酒精計）。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗室酒醅最佳發(fā)酵溫度及時間的測定

由實驗室酒醅發(fā)酵實驗可以得出，在不同溫度下，時間在21 d的酒醅發(fā)酵最好，25℃酒醅發(fā)酵較差，30℃、35℃酒醅發(fā)酵后酒精含量、總酸含量接近，而總酯含量相差明顯，35℃酒醅發(fā)酵最佳，所以之后的酒醅發(fā)酵均選在35℃培養(yǎng)發(fā)酵21 d。

2.2 混合細(xì)菌菌株的實驗室發(fā)酵實驗

2.2.1 細(xì)菌間抑制作用

28組細(xì)菌組合培養(yǎng)24 h后，有些組細(xì)菌已經(jīng)相結(jié)合，有些組細(xì)菌正相互結(jié)合，而有些組分開生長明顯。再經(jīng)48 h培養(yǎng)，生長情況如表1所示，細(xì)菌間14組、24組、25組、35組、36組、37組相互排斥生長，其余組細(xì)菌均相融合。

根據(jù)細(xì)菌間抑制實驗結(jié)果，選擇混合3株細(xì)菌有：123、126、127、128、138、156、157、158、167、168、178、238、267、268、278、348、456、457、458、467、468、478、567、568、578、678。

表1 48 h后細(xì)菌間相互抑制作用結(jié)果

表2 混合細(xì)菌強(qiáng)化酒醅實驗結(jié)果

2.2.2 混合細(xì)菌強(qiáng)化實驗室酒醅發(fā)酵

26組混合細(xì)菌強(qiáng)化實驗結(jié)果見表2。根據(jù)總酯含量大小順序排列，前8位的組合有156、268、128、123、457、478、168、468，且總酯含量在0.7 g/L以上，空白對照組酒精度、總酸含量、總酯含量分別是2.9%vol、0.53 g/L、0.50 g/L，將這8組樣品及空白對照保留作色譜實驗。

2.2.3 強(qiáng)化酒醅餾出液四甲基吡嗪含量測定（圖1）

由圖1可知，各強(qiáng)化餾出液中四甲基吡嗪的含量均大于空白組，表明強(qiáng)化后的酒醅均能提高四甲基吡嗪含量。其中，123組提高程度最高，實驗室強(qiáng)化酒醅中四甲基吡嗪含量是空白酒醅的1.8倍，這與蛋白酶活力高有一定關(guān)系。所以選擇123組做混合細(xì)菌菌株的入窖試驗，進(jìn)一步對混合細(xì)菌的應(yīng)用效果加以確認(rèn)。

圖1 餾出液四甲基吡嗪含量測定結(jié)果

2.3 混合酵母菌株的實驗室發(fā)酵實驗（圖2）

圖2是發(fā)酵酵母與產(chǎn)酯酵母混合強(qiáng)化酒醅結(jié)果，F(xiàn)1Z3組合酵母，發(fā)酵后酒精含量略高于空白對照，乙酸乙酯含量提高，異戊醇含量超過空白，但相對不高，所以此組合是能在提高白酒風(fēng)味的同時不影響出酒率，是發(fā)酵的最佳組合，所以混合酵母菌株入窖選擇組合F1Z3。

2.4 混合細(xì)菌菌株、酵母菌株的入窖生產(chǎn)實驗

表3是試驗酒廠和參照窖池的第5排基酒的各

成分平均值。6個排次結(jié)束后，計算每個窖池的原料出酒率（以65%vol酒精計），參照窖池的平均出酒率為24.4%，通過F1Z3混合酵母加強(qiáng)的3個試驗窖池出酒率分別為25.3%、24.2%、24.9%，說明混合酵母試驗未影響出酒率，而且結(jié)果如表3所示，測定出的酯類中甲酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、戊酸乙酯、乳酸乙酯、己酸丁酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯9種酯類的含量提高，同時高級醇類的含量（仲丁醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、活性戊醇、異戊醇、正戊醇、2-戊醇）有所下降。1Z3混合酵母強(qiáng)化酒醅試驗得到了初步成功驗證?；旌霞?xì)菌的實驗結(jié)果，表明上述實驗方式均未影響出酒率，出酒率詳見表4，兩種強(qiáng)化方式與參照窖池對比，均起到了提高四甲基吡嗪含量的作用，且兩種方式的提高程度不同，直接強(qiáng)化酒醅提高了4%，而堆積強(qiáng)化方式提高了12%，分析認(rèn)為，123組混合細(xì)菌菌株在堆積期間得以繁殖生長，成為了入窖時的強(qiáng)勢細(xì)菌群，菌種高產(chǎn)蛋白酶，分解更多原料中的蛋白質(zhì)生成四甲基吡嗪的前體氨基酸，使得菌種能夠加以利用，產(chǎn)生更多的四甲基吡嗪。

表3 混合功能菌株強(qiáng)化酒醅入窖實驗

圖2 混合酵母強(qiáng)化酒醅實驗測定結(jié)果

3 結(jié)論

混合酵母試驗中，在未影響試驗窖池的出酒率情況下，提高了白酒中酯類物質(zhì)的含量，其中分別有甲酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯等9種酯類，乙酸乙酯是我們考查的重點酯類物質(zhì)，其含量提高了18.9%，同時高級醇類中正丙醇的含量下降了3.9%，異戊醇的含量下降了30.7%，故F1Z3混合酵母強(qiáng)化酒醅試驗取得了初步的成功。而混合細(xì)菌的試驗證明了細(xì)菌在強(qiáng)化堆積酒醅時，有較強(qiáng)的提高四甲基吡嗪含量的作用。

表4 試驗窖池與參照窖池的醬香型白酒的原料出酒率(65%vol酒精計)

經(jīng)過前期的實驗室酒醅發(fā)酵實驗的摸索，以及最近混合菌種的測試探索，選出混合酵母F1Z3組和混合細(xì)菌123組進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用試驗。入窖試驗分別是混合細(xì)菌直接入窖、混合細(xì)菌堆積入窖、混合酵母直接入窖試驗，3組試驗與對照組比較均有不同程度的提高。細(xì)菌強(qiáng)化酒醅試驗有助于白酒中四甲基吡嗪含量的提高，堆積入窖的強(qiáng)化方式提高較高，使四甲基吡嗪含量提高了12%，直接入窖的強(qiáng)化方式使四甲基吡嗪含量提高了4%。酵母強(qiáng)化酒醅試驗在沒有影響出酒率的前提下，9種酯類得到了不同程度的提高，8種高級醇類含量有所降低。所以，功能菌庫中優(yōu)良菌種的生產(chǎn)應(yīng)用試驗取得了初步成功。