黃啟紅熊 娟 蔡大川 張志軍 黃璇瑩 陳敏兒 伍玲燕

（中國廣州分析測試中心，廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東廣州 510070）

潔凈室在微生物檢測過程中處于核心地位，直接決定檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。如果潔凈室的潔凈度不達標(biāo)，或因為其他原因受到污染，微生物檢測過程將得不到控制，最終的檢測結(jié)果數(shù)據(jù)也是無效的。因此，微生物實驗室在把控檢測質(zhì)量時必須嚴(yán)格按照潔凈室管理維護操作規(guī)程的要求，做好潔凈度監(jiān)控。本文從微生物檢測實際經(jīng)驗出發(fā)，對微生物潔凈室的管理維護進行了闡述和討論，希望為微生物檢測的同行和相關(guān)從業(yè)人員提供參考依據(jù)。

1 職責(zé)

1.1 操作人員職責(zé)

操作人員進行微生物檢測時，應(yīng)按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法及微生物實驗室規(guī)程進行操作，并填寫相關(guān)記錄表。

1.2 管理人員職責(zé)

管理人員負(fù)責(zé)潔凈室的日常運作和督促檢查安全、衛(wèi)生和監(jiān)測。

1.3 質(zhì)量監(jiān)督人員職責(zé)

質(zhì)量監(jiān)督人員負(fù)責(zé)對員工進行定期監(jiān)督。

2 操作程序

2.1 檢驗人員

a）檢測人員應(yīng)熟悉生物檢測安全操作知識和消毒知識，并經(jīng)培訓(xùn)上崗。

b）現(xiàn)場采樣時，必須有2人參加，并對抽樣設(shè)備進行嚴(yán)格消毒。采樣時穿白大褂，佩戴手套和口罩做到無菌操作采樣，并填寫采樣記錄。

2.2 設(shè)施和環(huán)境條件

a）對需要在無菌條件下工作的區(qū)域（潔凈室），應(yīng)有明確標(biāo)識。常規(guī)微生物項目在潔凈操作臺檢驗，致病菌在生物安全柜檢測。

b）潔凈室使用前必須打開潔凈室的紫外燈輻照滅菌30min以上，操作人員進入潔凈室前應(yīng)先關(guān)掉紫外燈，并且同時打開通風(fēng)過濾系統(tǒng)。操作完畢后，及時清理潔凈室，并關(guān)閉通風(fēng)過濾系統(tǒng)。

c）實驗人員進入潔凈室前，必須在緩沖間更換專用鞋，然后洗手消毒，更換工作服，戴好帽子、口罩等，做好各項防護措施，方可進入潔凈室進行操作。非實驗人員不準(zhǔn)進入潔凈室，確因工作需要或上級部門檢查工作時，經(jīng)室主任批準(zhǔn)后，更換鞋、衣服后進入，并在《進入潔凈室人員登記表》上登記。

d）工作人員在潔凈室內(nèi)工作時，動作要輕，嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作規(guī)程，盡量避免與工作無關(guān)的談話，不做易發(fā)塵和大幅度的動作，防止微生物污染。

e）潔凈室應(yīng)保持清潔，嚴(yán)禁堆放雜物，以防污染。潔凈室的地拖、抹布等清潔工具應(yīng)標(biāo)識清楚，與非潔凈室的嚴(yán)格區(qū)分。潔凈室應(yīng)定期清潔消毒并做好監(jiān)控記錄。

2.3 實驗工器具

a）需要帶入潔凈室使用的儀器、器械（如剪刀、鑷子、藥匙等）、玻璃器皿等所有物品，均應(yīng)包扎嚴(yán)密，并應(yīng)經(jīng)過適宜的方法消毒滅菌。滅菌后的器具和器皿存放于潔凈室內(nèi)，并標(biāo)識清楚。

b）未經(jīng)消毒的器具存放于前處理室。

2.4 檢測樣品處理

a）檢測樣品按樣品保存條件要求進行保存。需冷藏、冷凍的樣品貯存在樣品冰箱中，并做好檢測狀態(tài)標(biāo)識。b）樣品稱量需在潔凈室內(nèi)進行，防止被污染。c）所有的檢測樣品及用具均應(yīng)從經(jīng)消毒的傳遞窗傳遞。

2.5 檢測質(zhì)量控制

a）吸取菌液時，必須用吸耳球吸取，切勿直接用口接觸吸管。

b）如有菌液灑在桌上或地上，應(yīng)立即用配制好的二氧化氯消毒液傾覆在被污染處至少30min，再做處理。

c）潔凈室應(yīng)每2個星期進行沉降菌測試。

d）檢測人員應(yīng)嚴(yán)格按作業(yè)指導(dǎo)書規(guī)范操作。

e）檢測所用培養(yǎng)基必須從合格供應(yīng)商處采購，并經(jīng)驗收合格后方可使用。

f）外部質(zhì)量控制。按中心年度質(zhì)量控制計劃積極參加實驗室能力驗證和實驗間比對活動，確保檢測質(zhì)量。

g）內(nèi)部質(zhì)量控制。在每次檢測過程中，實驗室應(yīng)根據(jù)需要設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照，定期對檢驗過程進行質(zhì)量控制。

2.6 潔凈室沉降菌的測試

2.6.1 測試前準(zhǔn)備

測試前先打開潔凈室的紫外燈輻照滅菌30min以上，然后關(guān)閉紫外燈，并且同時打開送排風(fēng)系統(tǒng)和監(jiān)控系統(tǒng)，在凈化空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)正常運行時間不少于10min后進入測試。

2.6.2 測試狀態(tài)

靜態(tài)測試，要求室內(nèi)測試人員不得多于2人。

2.6.3 采樣點數(shù)量及其布置

當(dāng)潔凈室面積≤30m2時，取樣點定為從所設(shè)定的一條對角線上選取3點，即中心1點，兩端各距墻1m處各1點。當(dāng)潔凈室面積≥30 m2時，選取東、南、西、北、中5點，其中東點、南點、西點、北點均距墻1m。生物安全柜采用5點采樣法布點，采樣點位置分布示意圖同圖1。

圖1 工作區(qū)潔凈度采樣點位置分布示意圖

2.6.4 培養(yǎng)基選用

測試菌落總數(shù)時選擇大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA），測試霉菌或酵母菌時選用沙氏培養(yǎng)基（SDA）。

2.6.5 測試步驟

潔凈室沉降菌測定步驟如下：將已制備好的培養(yǎng)皿按采樣點布置圖逐個放置，然后從里到外逐個打開培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)皿表面暴露在空氣中。按照靜態(tài)測試法，培養(yǎng)皿暴露時間為30min。全部采樣結(jié)束后，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）配制的培養(yǎng)皿經(jīng)采樣后，在30℃～35℃培養(yǎng)48 h±2 h；采用沙氏培養(yǎng)基（SDA）的培養(yǎng)皿經(jīng)采樣后，在20℃～25℃培養(yǎng)5 d。每次取3個對照皿，與采樣皿同法操作但不需暴露采樣，然后與采樣后的培養(yǎng)皿（TSA或SDA）一起放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，結(jié)果應(yīng)無菌落生長。

生物安全柜沉降菌測試步驟如下：在每個取樣點并列放置3個平皿，共放置15個平皿，暴露30 min。測試菌落總數(shù)時采樣后將大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA） 平皿放入30℃～35℃的恒溫培養(yǎng)箱中，并用2塊空白平皿作為陰性對照，培養(yǎng)48 h±2 h，計數(shù)并判定結(jié)果。測試霉菌或酵母菌時,采用沙氏培養(yǎng)基（SDA）的培養(yǎng)皿經(jīng)采樣后，在20℃～25℃培養(yǎng)5 d。

2.6.6 沉降菌菌落計數(shù)

用肉眼對培養(yǎng)皿上所有的菌落直接計數(shù)、標(biāo)記或在菌落計數(shù)器上計，然后用5～10倍放大鏡檢查是否有遺漏。若平板上有2個或2個以上的菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上菌落計數(shù)，沉降菌的數(shù)目以個/皿表示。

2.6.7 采樣次數(shù)

每個采樣點采樣1次。

2.6.8 采樣注意事項

a）單向流潔凈室（區(qū)） 或送風(fēng)口，采樣器采樣口朝向應(yīng)正對氣流方向；

b）布置采樣點時，至少應(yīng)盡量避開塵粒集中的回風(fēng)口；

c）采樣時，測試人員應(yīng)站在采樣口的下風(fēng)側(cè)，并盡量少走動；

d）應(yīng)采取一切措施防止采樣過程中的污染和其他可能對樣品的污染。

2.6.9 記錄

按要求填寫潔凈室監(jiān)控記錄。

2.6.10 結(jié)果計算

每個測定點的沉降菌平均菌落數(shù)的計算公式如下：

平均菌落數(shù)＝（1號培養(yǎng)皿菌落數(shù)+2號培養(yǎng)皿菌落數(shù)+……n號培養(yǎng)皿菌落數(shù)）÷n

2.6.11 結(jié)果評定

每個測定點的沉降菌平均菌落數(shù)必須低于所選定評定標(biāo)準(zhǔn)的界限，在靜態(tài)測試時，若某個測定點的沉降菌平均菌落數(shù)超過評定標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)對潔凈室進行徹底消毒滅菌，然后重新采樣2次，測試結(jié)果達到評定標(biāo)準(zhǔn)方能判為合格。評定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 評定標(biāo)準(zhǔn)

2.7 廢物（液） 的處理

a）致病菌樣品檢測完后，需經(jīng)傳遞窗傳出到滅菌間，經(jīng)高溫高壓滅菌后方能進行清潔處理。

b）廢物（液）絕不允許傾倒于下水道中，應(yīng)定期通知中心辦公室將廢物（液）交由有資質(zhì)的單位進行處理，并對廢物（液）的滅菌處理進行記錄。

3 結(jié)論

微生物潔凈室的管理和檢測質(zhì)量息息相關(guān)，潔凈室的管理維護是一個持續(xù)的過程，應(yīng)重視制度、人員等起到的作用，重視日常管理維護措施，保障潔凈室的潔凈度，才能確保檢測質(zhì)量。本研究探討適用于潔凈室的管理與檢測質(zhì)量控制，可為微生物潔凈室管理和維護提供實用性的參考。