陳薊 劉弼 熊怡勝 黃雪晴

（暨南大學第二臨床醫(yī)學院深圳市人民醫(yī)院骨科，廣東 深圳 518020）

在骨關節(jié)炎（osteoarthritis,OA）研究中，已有越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)與關節(jié)炎的發(fā)生有千絲萬縷的聯(lián)系，Microrna-34a（miR-34a）是其中之一[1]。已有研究[2]表明，miR-34a通過調(diào)節(jié)細胞周期從G1期過渡到S期，有抗增殖作用，miR-34a同樣能由p53誘導，從而促進細胞凋亡和細胞周期阻滯。Sirt1基因亦是已被證實在OA發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[3]；然而miR-34a調(diào)控Sirt1在骨關節(jié)炎、軟骨細胞中的研究報道較少見。本實驗研究在IL-1β誘導的軟骨細胞模型中，miR-34a對Sirt1的作用及其對Bcl-2的表達影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone)；DAPI染色試劑盒（Sigma）；Lipofectamine 2000、RT-PCR試劑盒（Invitrogen）；miR-34a mimic（RiboBio）；Sirt1抗體、GAPDH抗體（Santa Cruz）；Bcl-2抗體（Bioss）；低溫高速離心機（Eppendorf）；DNA擴增儀（Biometra）。

1.2 實驗方法

1.2.1 C57BL/6J小鼠膝關節(jié)軟骨細胞的分離、純化、培養(yǎng)和刺激處理：無菌操作下取小鼠雙膝關節(jié)，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline,PBS）沖洗，剪取全部膝關節(jié)軟骨。在顯微鏡下去除關節(jié)囊周圍組織，并將軟骨組織與深層組織仔細分離。剪碎軟骨組織后用0.2%II型膠原酶消化4～6 h，離心去上清，培養(yǎng)基洗滌后再用含15%胎牛血清培養(yǎng)液分散培養(yǎng)。隨機分為兩組，正常對照組與IL-1β組，IL-1β終濃度為100 ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)，在加入IL-1β后24 h進行觀察和檢測。

1.2.2 DAPI染色與流式細胞術觀察軟骨細胞凋亡：取第2代軟骨細胞，調(diào)整密度為2×105/ml，接種于6孔板進行爬片。IL-1β組和對照組分別干預，24 h后按照DAPI染色試劑盒及AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒說明書操作，觀察細胞凋亡情況。

1.2.3 熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C：分別構建包含miR-34a種子序列結合位點野生型質(zhì)粒、包含種子序列突變位點的突變型質(zhì)粒（pmir-Glo-SIRT1-3’UTR WT和Mut），與miR-34a的mimics共轉(zhuǎn)染軟骨細胞后，測定螢光素酶活性，觀察miR-34a對野生型以及突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時的熒光素酶活力的影響。

1.2.4 RT-PCR檢測miR-34a和Sirt1 mRNA表達：根據(jù)試劑盒的說明提取軟骨細胞總RNA，包括miRNA。標準方案RT-PCR檢測軟骨細胞中miR-34a和Sirt1 mRNA表達。

1.2.5 Western Blot檢測Sirt1、Bcl-2蛋白表達：根據(jù)IL-1β濃度（0 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml）分為a、b、c、d組，細胞經(jīng)過處理后，提取總蛋白，并測定蛋白濃度，根據(jù)Western Blot實驗步驟檢測軟骨細胞中Sirt1、Bcl-2的蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DAPI染色及流式細胞術檢測細胞凋亡結果

細胞接種于6孔板進行細胞爬片，然后分為A組（對照組）、B組（實驗組），用DAPI染色，于熒光顯微鏡下觀察并照相（圖1）。同時用AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒檢測細胞凋亡（圖2）。

2.2 觀察miR-34 a對野生型以及突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時的熒光素酶活力的影響，驗證miR-34 a靶向Sirt 1

通過搜索miRDB以及TargetScan的序列分析，

圖1 DAPI染色檢測細胞凋亡（100×）

2.3 RT-PCR檢測軟骨細胞中miR-34 a和Sirt 1 mRNA表達

在體外培養(yǎng)軟骨細胞，給予100 ng/ml IL-1β刺激，然后RT-PCR檢測miR-34a（圖4A）和Sirt1 mRNA（圖4B）表達，與正常細胞對照組比較，IL-1β組miR-34a表達升高，Sirt1表達降低（P＜0.05）。這說明過表達miR-34a，導致Sirt1表達降低（圖4）。

2.4 WesternBlot實驗檢測軟骨細胞中Sirt 1、Bcl- 2蛋白表達

發(fā)現(xiàn)Sirt1 3’UTR的746～752堿基可能是miR-34a的結合位點。同時將miR-34a的mimics與野生型Sirt1-Luc熒光素酶報告基因載體共轉(zhuǎn)染軟骨細胞后，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，細胞熒光素酶活性顯著下降（P＜0.05），說明miR-34a能靶向作用Sirt1，并抑制螢光素酶的表達（圖3）。

在體外培養(yǎng)軟骨細胞，根據(jù)IL-1β濃度（0 ng/ml、10 ng/ml、50ng/ml、100ng/ml）分為a、b、c、d組，與a組（對照組）比較，b、c、d組Sirt1、Bcl-2蛋白表達降低（P＜0.05）。這說明低表達Sirt1，Bcl-2表達同時亦降低（圖5）。

3 討論

圖2 流式細胞術檢測細胞凋亡

圖3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

圖4 RT-PCR檢測軟骨細胞中miR-34a和Sirt1 mRNA表達

骨關節(jié)炎是一種退行性關節(jié)疾病，由多種因素引起，如衰老、肥胖、創(chuàng)傷等。許多文獻[4,5]將OA的發(fā)生發(fā)展機制歸因于軟骨細胞反應性調(diào)節(jié)紊亂。這種紊亂造成合成代謝與分解代謝之間的失衡，具體表現(xiàn)為基質(zhì)降解酶類的產(chǎn)生和軟骨細胞的凋亡。

Sirt1是Sirtuin家族的一員，作為組蛋白脫乙?；敢雅c年齡相關的疾病聯(lián)系在一起，如II型糖尿病、老年癡呆癥、骨質(zhì)疏松癥等[6,7]。越來越多的證據(jù)表明，Sirt1在OA發(fā)生發(fā)展中起重要作用。有學者[3]研究發(fā)現(xiàn)，在軟骨細胞中，抑制Sirt1可以降低COL10A1和ADAMTS-5的表達，從而促進OA進程。同樣，抑制Sirt1可以通過線粒體-相關信號促進細胞凋亡[8]。

在過去的幾年中，MicroRNA因其在軟骨細胞中的重要作用而越來越受到人們的關注。據(jù)報道[9]，在軟骨細胞中，調(diào)節(jié)miR-145靶向Smad3，可造成其下游靶基因的表達改變，從而引起IL-1β誘導細胞外基質(zhì)降解。Jin等[10]發(fā)現(xiàn)，miR-146a通過調(diào)節(jié)VEGF和TGF-β的信號通路參與人軟骨細胞凋亡與OA的進程。

MicroRNA-34家族包括miR-34a、miR-34b、miR-34c。已有研究表明，miR-34a通過調(diào)節(jié)細胞周期從G1過渡到S期具有抗增殖作用，miR-34a同樣能由p53誘導，從而促進細胞凋亡和細胞周期阻滯。miR-34a可以調(diào)控IL-1β誘導的COL2A1和iNOS表達，當沉默miR-34a時，IL-1β誘導的鼠軟骨細胞凋亡明顯減少，同時可以阻止IL-1β誘導的II型膠原蛋白降解[2,11]。

Sirt1在OA發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，同時miR-34a亦參與調(diào)節(jié)OA過程，那么miR-34a與Sirt1之間如何作用來調(diào)控OA的發(fā)生發(fā)展及其具體機制，值得進一步深入研究。通過生物信息學軟件預測及文獻搜索發(fā)現(xiàn)，Sirt1作為miR-34a的靶基因，在腫瘤細胞、肝臟、胰腺等細胞及組織器官中起重要作用[12,13]。然而miR-34a調(diào)控Sirt1在OA、軟骨細胞中的研究報道較少見。因此，在體外培養(yǎng)軟骨細胞，給予IL-1β刺激，發(fā)現(xiàn)miR-34a表達升高，Sirt1表達隨之降低。同時采用熒光素酶報告基因檢測驗證miR-34a的靶基因Sirt1，發(fā)現(xiàn)將miR-34a的mimics與野生型Sirt1-Luc熒光素酶報告基因載體共轉(zhuǎn)染軟骨細胞后，細胞熒光素酶活性顯著下降。表明miR-34a能靶向作用Sirt1，并抑制螢光素酶的表達。這說明過表達miR-34a降低Sirt1，可能是誘導軟骨細胞凋亡加速OA進程的重要原因。

圖5 Western Blot實驗檢測軟骨細胞中Sirt1、Bcl-2蛋白表達

Bcl-2與細胞凋亡密切相關，其具有抑制細胞凋亡的作用。有學者[8]研究發(fā)現(xiàn)，激活Sirt1可以調(diào)控Bcl-2抑制軟骨細胞凋亡。本研究中，隨著IL-1β濃度逐漸增加，Sirt1、Bcl-2表達降低。說明低表達Sirt1，可以降低Bcl-2，從而誘導軟骨細胞凋亡。

綜上所述，在IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡模型中，miR-34a的表達增加，其可以靶向Sirt1進而降低Bcl-2，誘導軟骨細胞凋亡。既然，miR-34a靶向Sirt1誘導軟骨細胞凋亡，那么沉默miR-34a，Sirt1表達增加，從而可以抑制軟骨細胞凋亡。這表明沉默miR-34a可能成為治療OA的新方法，這為研究防止OA進程提供了新的靶點。然而，miR-34a靶向Sirt1調(diào)控軟骨細胞凋亡，是否還有其他通路或者分子受其調(diào)節(jié)，目前尚不明確。有學者[14]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可通過p53、NF-κB、Ku70和FOXOs等通路影響軟骨細胞凋亡，同時iNOS、COX-2以及MMP-13的表達亦發(fā)生改變[15]。是否miR-34a靶向Sirt1亦能參與這些調(diào)節(jié)過程，需要進一步深入研究。

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