孫軍營(yíng) 林健靜 欒昕宇 王方曦 李國(guó)慶 張衛(wèi)飛 曾暉

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，廣東 深圳 518036）

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種常見的嚴(yán)重影響患者日常活動(dòng)能力的慢性致殘性疾病。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，OA的發(fā)病主要集中在老年人群，隨著年齡的增長(zhǎng)，OA的發(fā)病率出現(xiàn)逐步遞增的趨勢(shì)[1,2]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)調(diào)查和統(tǒng)計(jì)顯示，全世界＞50歲人群中約50%患有OA，而在＞75歲人群中OA發(fā)病率為80%。在中國(guó)人口中，50歲以上人群中OA的發(fā)病率達(dá)60.70%，且這一數(shù)值以每年0.24%的速度急速攀升[3,4]。OA的發(fā)病與年齡因素高度相關(guān)，故老齡化被視為導(dǎo)致OA發(fā)生的最危險(xiǎn)致病因素之一。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（sirtuin type 1,Sirt1）作為Sir2的同源體，含一個(gè)高度保守的催化核心序列，廣泛存在于哺乳動(dòng)物染色質(zhì)中，依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）[5]，能通過(guò)不同的分子信號(hào)通路參與機(jī)體代謝、延長(zhǎng)壽命、控制細(xì)胞分化、增殖、凋亡及抑制炎癥等生物反應(yīng)[6,7]。白藜蘆醇（resveratrol,Res）是一種多酚類化合物，可從植物中提取得到，是現(xiàn)階段研究最廣泛的Sirt1特異選擇性激活劑，EX-527則是一種常用的Sirt1特異選擇性抑制劑。目前，Sirt1在OA中的作用越來(lái)越受到人們關(guān)注。近來(lái)研究[7,8]發(fā)現(xiàn)，在OA累及的軟骨中，Sirt1的表達(dá)降低，同樣在Sirt1基因被敲除的小鼠中，OA的進(jìn)展更快更嚴(yán)重。一系列研究表明，Sirt1能夠延緩OA的發(fā)展，起重要的保護(hù)作用。但其具體的作用機(jī)制尚不十分明確。

關(guān)節(jié)軟骨退變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生是OA的中心環(huán)節(jié)，而軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的異常改變是導(dǎo)致軟骨退變的重要原因之一[9-12]。故本研究擬通過(guò)體外分離并培養(yǎng)小鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，分別加入Sirt1的激動(dòng)劑和抑制劑，比較組別軟骨細(xì)胞Sirt1表達(dá)和軟骨細(xì)胞ECM合成及降解的情況，探究Sirt1對(duì)軟骨細(xì)胞ECM的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

5日齡C57BL/6J小鼠（北京大學(xué)/香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心，深圳醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），細(xì)胞培養(yǎng)基的改進(jìn)型1640（Hyclone公司）；牛血清白蛋白（BSA）、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、胎牛血清（fetal bovine serun,FBS）（Gibco公司），雙抗（青霉素和鏈霉素）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline,PBS）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）、白藜蘆醇、EX-527、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）（Sigma公司）；TRE-trizol（Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光PCR試劑盒（TaKaRa公司），熒光定量PCR引物（生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成）；anti-Sirt1抗體、anti-CollagenⅡ 抗體（Abcam公司），二抗（碧云天公司）。

1.2 分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)分組

5只5日齡C57BL/6J小鼠被取出，脫頸處死，浸泡在75%酒精中消毒5 min，超凈臺(tái)無(wú)菌條件下小鼠雙后肢被眼科剪剪斷，剪取膝關(guān)節(jié)骨骺端的透明軟骨組織，沖洗3次PBS，利用眼科剪將軟骨組織剪成1 mm3大小的碎組織塊。用15 ml離心管裝碎組織塊，加入0.25%胰蛋白酶1 ml后，混勻充分，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)消化45 min，加入1 ml含有10%FBS的1640培養(yǎng)液終止消化，進(jìn)行5 min離心，1000 r/min，棄去上清液。然后加入1 ml無(wú)菌的0.2%Ⅱ型膠原酶，放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行37℃，5 h消化，然后加入含有10%FBS的1640培養(yǎng)液1 ml來(lái)終止消化，1000 r/min，離心5 min，棄去上清。將含有l(wèi)%鏈霉素/青霉素雙抗和10%FBS的1640培養(yǎng)基加入制成細(xì)胞懸浮液，根據(jù)4×105/ml的細(xì)胞密度，將軟骨細(xì)胞均勻接種在25 cm2大小的培養(yǎng)瓶中。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，箱內(nèi)5%CO2飽和濕度，恒溫37℃。每間隔2 d更換1次培養(yǎng)基，等到軟骨細(xì)胞融合度達(dá)75%以上，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞一般選取二代的傳代細(xì)胞。

細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×104個(gè)/ml，6孔板中加入細(xì)胞懸液，2 ml/每孔，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，箱內(nèi)5%CO2飽和濕度，恒溫37℃。待細(xì)胞融合度約為80%時(shí)，隨機(jī)分為3組，并分別按以下方式處理：①空白對(duì)照組，僅加入DMSO干預(yù)36 h。②EX-527組，予以EX-527 干預(yù) 36 h（終濃度為 10 μmol/L）。③白藜蘆醇組,予以白藜蘆醇干預(yù)36 h（終濃度為100 μmol/L）。

1.3 甲苯胺藍(lán)染色鑒定軟骨細(xì)胞

選取生長(zhǎng)良好的軟骨細(xì)胞，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×104個(gè)/ml，24孔板中進(jìn)行爬片，1 ml細(xì)胞懸液加入到各孔后放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，箱內(nèi)5%CO2飽和濕度，恒溫37℃。利用PBS液漂洗3次，每次至少5 min，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS液再漂洗3次，每次5 min，然后甲苯胺藍(lán)溶液染色，在搖床上緩慢震蕩4 h，PBS液共洗3次，每次5 min，最后在室溫下放置至少10 min晾干，封片，進(jìn)行顯微鏡下觀察。

1.4 II型膠原免疫熒光檢測(cè)

選取一些生長(zhǎng)良好的軟骨細(xì)胞，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×104個(gè)/ml，24孔板中進(jìn)行爬片，1 ml細(xì)胞懸液加入到各孔后放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，箱內(nèi)5%CO2飽和濕度，恒溫37℃。利用PBS液漂洗3次，每次5 min，再用4%多聚甲醛固定15 min，PBS液繼續(xù)洗3次，每次5 min，5%BSA封閉液30 min封閉，加入Ⅱ型膠原一抗4℃過(guò)夜，PBS液漂洗3次，每次5 min，加入Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）后室溫下放置30 min以上，進(jìn)行熒光顯微鏡下觀察。

1.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

收集在不同實(shí)驗(yàn)條件要求下進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞，利用Trizol法分別提取各組細(xì)胞總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA公司）合成cDNA，根據(jù)目的基因退火溫度選擇三步法進(jìn)行擴(kuò)增，完成循環(huán)數(shù)40次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）為內(nèi)參，根據(jù)熔解曲線判斷RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。利用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊性檢驗(yàn)后，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鏡下觀察小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞

倒置顯微鏡下顯示，在不同培養(yǎng)階段小鼠軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)也不同：①培養(yǎng)0 d的軟骨細(xì)胞尚未貼壁，呈圓形，大小均一，均勻懸浮在培養(yǎng)液中（圖1A）；②1 d后，細(xì)胞完全貼壁，細(xì)胞形態(tài)呈三角形、多角形，均勻散在生長(zhǎng)于培養(yǎng)瓶底壁（圖1B）；③5 d后，細(xì)胞完全融合，呈現(xiàn)出“鋪路石”樣外觀，單層鋪滿于培養(yǎng)瓶瓶底（圖1C）。

2.2 細(xì)胞活性檢測(cè)

用臺(tái)盼藍(lán)染細(xì)胞，死細(xì)胞著藍(lán)色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。原代軟骨細(xì)胞在未貼壁前檢測(cè)，活細(xì)胞率約90%。傳代后，軟骨細(xì)胞活性增高可達(dá)到95%以上。傳代次數(shù)越多，尤其在傳至6代以后，細(xì)胞活性出現(xiàn)明顯下降，細(xì)胞形態(tài)變化顯著，大小不均等且細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)有黑色顆粒。

圖1 鏡下觀察小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞（100×）

2.3 軟骨細(xì)胞HE染色和苯胺藍(lán)染色觀察

細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)等酸性物質(zhì)可與蘇木素結(jié)合呈現(xiàn)藍(lán)色，而細(xì)胞質(zhì)中的堿性蛋白等物質(zhì)可與伊紅結(jié)合呈現(xiàn)紅色，進(jìn)而可區(qū)分細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。染色后可以觀察到軟骨細(xì)胞核為圓形或者橢圓形，呈藍(lán)色，胞質(zhì)三角形或者多角形，呈粉紅色。甲苯胺藍(lán)為堿性染料,呈酸性的細(xì)胞核與其中有染色作用的陽(yáng)離子相結(jié)合而被染為藍(lán)色；而胞質(zhì)內(nèi)的異色性物質(zhì)遇到甲苯胺藍(lán)可呈現(xiàn)出紫紅色，染色后可以看到呈現(xiàn)藍(lán)色的軟骨細(xì)胞細(xì)胞核和呈現(xiàn)紫紅色的軟骨細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)（圖2）。

2.4 軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫熒光鑒定

Ⅱ型膠原由軟骨細(xì)胞分泌，是軟骨細(xì)胞的特異性標(biāo)志，可以作為鑒定軟骨細(xì)胞的特異性指標(biāo)[9]。如圖3所示，熒光顯微鏡下，軟骨細(xì)胞由于表達(dá)Ⅱ型膠原而被熒光染料染紅色熒光，軟骨細(xì)胞胞核被DAPI復(fù)染成藍(lán)色。細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫熒光陽(yáng)性率達(dá)90%以上，表明培養(yǎng)的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞，可以用于本次后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，白藜蘆醇組，Sirt1基因表達(dá)上調(diào)，Sox9、聚蛋白多糖和II型膠原的表達(dá)增多，MMP-3、MMP-13和 ADAMTS-5的表達(dá)減少（P＜0.05）；EX-527組，Sirt1基因表達(dá)下降，Sox9、聚蛋白多糖和II型膠原的表達(dá)減少，MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的表達(dá)增多（P＜0.05，圖4～5）。

圖2 軟骨細(xì)胞HE染色和甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果（200×）

圖3 軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫熒光鑒定（400×）

3 討論

Sirt1是哺乳動(dòng)物Sirtuin家族成員中目前研究最多的一種組蛋白去乙酰化酶，主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，由500個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為120 kDa，依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)發(fā)揮生物學(xué)作用，其功能為催化蛋白賴氨酸的去乙?；{(diào)控許多下游目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)新陳代謝、抑制炎癥、抗衰老、抗凋亡等多個(gè)方面的生物學(xué)效應(yīng)[13,14]。有研究表明Sirt1表達(dá)水平在OA關(guān)節(jié)軟骨中明顯降低，Sirt1可以影響OA發(fā)展[15,16]。

OA是一種慢性退行性疾病，在多種因素的共同作用下導(dǎo)致軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、軟骨下骨三者降解和合成失衡，臨床病理特征是軟骨破壞和關(guān)節(jié)間隙變窄，其細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)則是軟骨ECM的改變[17,18]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于OA的研究大多數(shù)著重于ECM合成與降解失衡而導(dǎo)致軟骨的破壞。

圖4 Sirt1、Sox9、聚蛋白多糖和Ⅱ型膠原mRNA的相對(duì)表達(dá)量

ECM是軟骨細(xì)胞間的填充，也是軟骨組織的支架，可以通過(guò)細(xì)胞膜上的受體與軟骨細(xì)胞發(fā)生聯(lián)系，它對(duì)軟骨細(xì)胞的增值、遷移、細(xì)胞間信號(hào)的傳遞以及機(jī)械應(yīng)力作用方面都發(fā)揮著重要作用[19,20]。ECM主要由膠原、聚蛋白多糖以及水構(gòu)成，此外，還有少量的無(wú)機(jī)鹽以及溶菌酶和脂類。II型膠原是關(guān)節(jié)軟骨特有的膠原，占膠原總量的80%～95%，占軟骨干重的60%[21]，和其他膠原構(gòu)成了ECM的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對(duì)關(guān)節(jié)的承受力和抗張力起到了至關(guān)重要的作用[22]。聚蛋白多糖約占軟骨濕重的5%～10%[23]，位于膠原的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)之間，保持軟骨組織的完整性，具有良好的親水性，對(duì)維持軟骨含水量起到重要作用，使軟骨具有良好的抗壓和抗沖擊能力。二者是關(guān)節(jié)軟骨的兩個(gè)主要成分，是軟骨細(xì)胞抵御和緩解外界機(jī)械壓力的主要保護(hù)屏障，它們由軟骨細(xì)胞合成和分泌[24]。同時(shí)軟骨細(xì)胞也會(huì)合成和分泌多種基質(zhì)降解酶，導(dǎo)致ECM的降解[25]。其中基質(zhì)金屬蛋白酶是軟骨ECM降解的主要介質(zhì)，可與循環(huán)系統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起快速降解軟骨，MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的作用尤為顯著[26-28]。另外，Sox9是軟骨形成過(guò)程中一個(gè)十分重要的轉(zhuǎn)錄因子，該基因的突變或缺失可導(dǎo)致軟骨發(fā)育的異?；驀?yán)重的先天性疾病[29]。因此，本研究采取檢測(cè)Ⅱ型膠原、聚蛋白多糖和Sox9的mRNA水平來(lái)表示ECM的合成情況，檢測(cè)MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的mRNA水平來(lái)表示ECM的降解情況。

本研究通過(guò)分別加入Sirt1基因的激活劑白藜蘆醇和抑制劑EX-527的方法來(lái)調(diào)節(jié)Sirt1的活性，同時(shí)觀察軟骨細(xì)胞ECM合成特異性基因Ⅱ型膠原、聚蛋白多糖和Sox9的mRNA表達(dá)水平以及降解特異性基因MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的mRNA表達(dá)情況，從而探討Sirt1基因與軟骨細(xì)胞ECM之間的關(guān)聯(lián)情況。

圖5 MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

本研究結(jié)果顯示，激活Sirt1基因?qū)е垄蛐湍z原、聚蛋白多糖和Sox9的表達(dá)明顯增加而MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的表達(dá)明顯減少，而抑制Sirt1基因?qū)е垄蛐湍z原、聚蛋白多糖和Sox9的表達(dá)明顯減少而MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的表達(dá)明顯增多。該結(jié)果表明，Sirt1基因的活性與Ⅱ型膠原、聚蛋白多糖和Sox9以及MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的表達(dá)具有相關(guān)性即與軟骨細(xì)胞ECM之間具有相關(guān)性。當(dāng)OA發(fā)生時(shí)，Sirt1基因的表達(dá)出現(xiàn)降低[30,31]，所以推測(cè)，低表達(dá)的Sirt1基因?qū)е垄蛐湍z原、聚蛋白多糖和Sox9的表達(dá)明顯減少而MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的表達(dá)明顯增多，最終，軟骨細(xì)胞ECM合成減少同時(shí)軟骨細(xì)胞ECM降解增加，進(jìn)而引起軟骨的破壞。所以，Sirt1基因能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞ECM的合成并且減緩軟骨細(xì)胞ECM的降解，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨起到保護(hù)作用。這說(shuō)明Sirt1基因?qū)A的作用機(jī)制可能通過(guò)影響軟骨細(xì)胞ECM而實(shí)現(xiàn)，又為進(jìn)一步研究OA的發(fā)病機(jī)制提供了一定的思路。然而Sirt1通過(guò)具體什么樣的途徑對(duì)軟骨細(xì)胞ECM發(fā)揮作用，本研究未能進(jìn)行，需要進(jìn)一步探索完善。另外，本實(shí)驗(yàn)是在沒有任何炎癥因子刺激下探究Sirt1對(duì)軟骨細(xì)胞ECM的作用，而OA發(fā)生時(shí)軟骨細(xì)胞處于炎性條件下，所以在炎性條件下Sirt1能否對(duì)軟骨細(xì)胞ECM發(fā)揮同樣的作用也是需要進(jìn)一步研究。

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