武 靜 楊莎莎 陳繼婷 王俊霞 楊 毅 龔小雪 王 慧

(1 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院,貴陽(yáng) 550002; 2 成都中醫(yī)藥大學(xué)博士研究生， 成都 610045)

慢性胃炎是指局限于胃黏膜層的慢性炎癥,是消化系統(tǒng)中最常見(jiàn)的一類(lèi)疾病,發(fā)病率高并常伴有癌變。它屬于中醫(yī)“胃脘痛”、“腹脹”、“嘈雜”、“痞證”等范疇。大建中湯作為治療脾陽(yáng)虛證的經(jīng)典方劑,療效確切,具有較高的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。本課題組前期的研究表明,大建中湯在治療脾陽(yáng)虛腹痛中,血栓素-2、6-酮前列腺素、P-物質(zhì)、COX-2等物質(zhì)均改善[1-3],這些物質(zhì)與炎癥關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)改良脾陽(yáng)虛胃炎動(dòng)物模型,RT-PCR、ELISA分別檢測(cè)單核細(xì)胞的白介素受體相關(guān)激酶4(interleukin-1 receptor-related kinase-4， IRAK-4) mRNA表達(dá)水平和血清白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)含量;并觀察胃黏膜的病理變化,以探討大建中湯治療脾陽(yáng)虛胃炎可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康清潔級(jí)SD大鼠60只,體質(zhì)量200g±20g,雌雄各半,由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào)：〔SCXK(渝)2012—000J〕。飼養(yǎng)條件：清潔、通風(fēng),溫度：15℃～25℃,濕度：55%～70%,混合飼料喂養(yǎng)。

1.2 分組和造模

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為6組,分為正常對(duì)照組,模型組,枸櫞酸鉍鉀對(duì)照組,大建中湯高、中、低劑量組,每組10只。實(shí)驗(yàn)大鼠模型復(fù)制參考姒氏造模方法[4]略加改進(jìn),造模各組大鼠復(fù)制脾陽(yáng)虛胃炎模型,主要分為2步。

1.2.1 脾陽(yáng)虛造模 將大鼠正常飼養(yǎng)調(diào)整3d,使之適應(yīng)環(huán)境后開(kāi)始造模(除正常組外)。整個(gè)造模過(guò)程分為兩大階段(均自由飲水),共3周。第1階段為前5d,飲食失節(jié)傷脾氣——單日喂飼甘藍(lán)10g/200g,雙日喂飼精煉豬脂2mL/200g;勞倦過(guò)度傷脾氣——每日38℃溫水中游泳至疲勞(疲勞的標(biāo)準(zhǔn)為不能堅(jiān)持游泳)。第2階段為后6～21d,除飲食失節(jié)及勞倦過(guò)度因素外,加上苦寒瀉下傷脾陽(yáng),每日加灌藩瀉葉水浸液2ml/200g。大鼠出現(xiàn)倦怠、喜聚堆、腹瀉、皮毛枯槁易落,不能堅(jiān)持游泳、肛周污濁、軀體扭曲等現(xiàn)象,說(shuō)明脾陽(yáng)虛造模成功。

1.2.2 脾陽(yáng)虛胃炎造模 脾陽(yáng)虛造模成功后,給脾陽(yáng)虛大鼠灌胃40%乙醇,每周一空腹1次,每次8ml/kg、20mmol/L去氧膽酸鈉灌胃,每日上午1次,每次8ml/kg;0.05%～0.1%氨水作為大鼠日常飲用水自由飲用,并記錄每日飲用量;0.05%吲哚美辛灌胃,每日下午1次,每次8ml/kg;并配以饑飽失常;連續(xù)90d后(每10d測(cè)體質(zhì)量1次),脾陽(yáng)虛胃炎動(dòng)物模型復(fù)制成功,再將模型動(dòng)物隨機(jī)分為脾陽(yáng)虛胃炎模型組、大建中湯大、中、小治療組和枸櫞酸鉍鉀對(duì)照組,每組10只。

1.3 試劑、藥品、儀器

單核細(xì)胞分離試劑盒(加拿大Stem Cell公司);總RNA提取試劑盒,cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Fermentas公司);IRAK-4引物由大連寶生物設(shè)計(jì)合成;RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司);TNF-α放射免疫試劑盒(購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司);IL-6放射免疫試劑盒(購(gòu)于上海研晶生化試劑有限公司);制作石蠟切片相關(guān)試劑,脫氧膽酸鈉(上海日初生物科技有限公司);無(wú)水乙醇(分析純),氨水(分析純)。

大建中湯(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院中藥制劑中心提供);100%番瀉葉水浸液(自制);枸櫞酸鉍鉀膠囊(麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠生產(chǎn),批號(hào)：261623);吲哚美辛腸溶片(重慶科瑞制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn),批號(hào)：111025),可加水溶解后灌胃。

TGL16A臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司);UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司); HH-S4雙列四孔恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市金南儀器制造有限公司);XSP-14A顯微鏡(上海光學(xué)儀器一廠);ProgRes?數(shù)碼顯微鏡照相機(jī)(業(yè)納上海儀器設(shè)備有限公司)等。

1.4 給藥方法

從造模第91天開(kāi)始分別給予各組大鼠相應(yīng)藥物灌服30d。具體為：正常對(duì)照組,灌服生理鹽水7ml·kg-1·d-1;造模型組,灌服生理鹽水7ml·kg-1·d-1;大建中湯高、中、低劑量治療組,分別灌服大建中湯0.75、1.5、3.0g·kg-1·d-1;受試藥對(duì)照組,灌服枸櫞酸鉍鉀膠囊0.0162g·kg-1·d-1。

1.5 標(biāo)本采集和保存

各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,禁食24h,麻醉大鼠股動(dòng)脈采血7ml,3000r/min離心15min(離心半徑15cm),分離血清,-20℃保存。同時(shí)采集靜脈血7ml,EDTA抗凝,按照Stem Cell公司的RosetteSep法提取外周血單核細(xì)胞(PBMC),-80℃保存。取大鼠胃小彎黏膜,-80℃ 保存。

1.6 病理組織學(xué)檢測(cè)

取胃組織用石蠟包埋,切片,蘇木素-伊紅(H-E)染色,光鏡下組織形態(tài)觀察。

1.7 放射免疫法測(cè)定血清

對(duì)IL-6、TNF-α的免疫活性進(jìn)行測(cè)定,并繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用放射免疫法測(cè)定其血清中IL-6、TNF-α含量,其操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟說(shuō)明進(jìn)行。

1.8 對(duì)大鼠IRAK-4 mRNA表達(dá)的測(cè)定

單核細(xì)胞中IRAK-4 mRNA 表達(dá)水平測(cè)定,用TRIzol試劑抽提單核細(xì)胞總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用SYBR GreenⅢ熒光定量檢測(cè)IRAK-4 mRNA水平。以β-actin的PCR產(chǎn)物為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn),β-actin 基因上游引物5′-TGGGGTGATGCTGGTGCT GAGT-3′,下游引物為5′-AGGTTTCTCCAGGCGGC ATGTC-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度500bp;IRAK-4基因的上游引物為5′-TGCCTACTGCGTGTTGGGATTA-3′,下游引物為5′-CACACACACCCTCCAAACTCACT-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為360bp;根據(jù)RT-PCR原始檢測(cè)結(jié)果,分析得出各個(gè)樣品的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 胃黏膜病理組織變化

光鏡觀察結(jié)果表明：正常對(duì)照組胃黏膜腺未見(jiàn)萎縮,黏膜上皮規(guī)則、整齊,固有層可見(jiàn)散在淋巴細(xì)胞;模型組大鼠胃黏膜腺萎縮,呈慢性炎癥表現(xiàn),固有層可見(jiàn)灶性浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞,有形成的淋巴濾泡,胃黏膜基層變厚;枸櫞酸鉍鉀組可見(jiàn)胃炎大鼠黏膜腺體輕度萎縮,漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞呈散在的彌漫性浸潤(rùn),有擴(kuò)張的小血管伴纖維增生,黏膜下層輕度增厚;大建中湯高劑量組大鼠胃黏膜有漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞呈散在浸潤(rùn);大建中湯中劑量組大鼠胃黏膜固有層可見(jiàn)淋巴細(xì)胞灶性浸潤(rùn),偶見(jiàn)擴(kuò)張的小血管;大建中湯低劑量組在鼠黏膜組織呈慢性炎癥,黏膜固有層可見(jiàn)漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜下層變厚(圖1)。

圖1 健脾溫胃散對(duì)大鼠胃組織病理學(xué)的影響(H-E,×200)Fig 1 Effects of Dajanzhong decoction on stomach tissue pathology in rats (H-E,×200)A: Normal control group; B: Model group; C: Test drug control group;D: Dajianzhong high-dose group; E: Dajianzhong medium dose group; F: Dajianzhong small dose group

2.3 大鼠TNF-α、IL-6含量的變化

與正常對(duì)照組相比,模型組TNF-α、IL-6含量明顯升高(P<0.01);與模型組相比大建中湯高、中劑量組TNF-α、IL-6含量明顯降低(P<0.01);大建中湯高、中劑量組與受試藥對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 各組大鼠TNF-α、IL-6含量變化Tab 1 Changes in TNF-α， IL-6 and IRAK-4 mRNA content in each group

#P<0.05,##P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsmodel

2.4 大鼠IRAK-4 mRNA表達(dá)的變化

與正常對(duì)照組比較,模型組中IRAK-4 mRNA表達(dá)明顯升高,與模型組相比大建中湯高、中、低劑量組IRAK-4 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01),大建中湯高、中、低劑量組與枹櫞酸鉍鉀對(duì)照組比較無(wú)差異(P>0.05)(表1,圖2)。

3 討論

中醫(yī)經(jīng)典方劑大建中湯以其在治療脾陽(yáng)虛胃腸疾病方面獨(dú)特的療效,被歷代醫(yī)家推崇。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為大建中湯具有溫中補(bǔ)虛,降逆止痛、扶正祛邪的功效。而現(xiàn)代研究表明其具有抗炎、抗感染、抗腫瘤、驅(qū)寒鎮(zhèn)痛的功效。大建中湯治療胃炎有效機(jī)制可能與抑制幽門(mén)螺旋桿菌、保護(hù)胃黏膜、抗炎,影響胃黏膜內(nèi)分泌細(xì)胞,胃腸激素的分泌,改善胃黏膜血流量等作用有關(guān)[5-6]。本課題組前期研究證實(shí)大建中湯治療脾陽(yáng)虛腹痛有效,同時(shí)能調(diào)節(jié)炎性因子的含量,表明大建中湯可能對(duì)炎癥有治療作用。

圖2 大建中湯對(duì)大鼠胃組織 IRAK-4 mRNA 表達(dá)的影響Fig 2 Effects of Dajanzhong decoction on IRAK-4 mRNA expression in stomach tissue of rats1: Normal control group; 2: Model group;3: Test drug control group; 4: Dajianzhong high-dose group;5: Dajianzhong medium dose group; 6: Dajianzhong small dose group

本研究通過(guò)飲食失調(diào)、勞倦過(guò)度、苦寒瀉下等措施,再先后應(yīng)用40%乙醇和20mmol/L去氧膽酸鈉灌胃大鼠,大鼠自由飲用0.1%氨水,之后用0.05%吲哚美辛灌胃,并配以饑飽失常,最終成功制造脾陽(yáng)虛胃炎模型。本實(shí)驗(yàn)也顯示,模型組大鼠胃黏膜腺萎縮,呈慢性炎癥表現(xiàn),固有層可見(jiàn)灶性浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞,有形成的淋巴濾泡,胃黏膜基層變厚;而大建中湯治療后大鼠胃黏膜腺體輕度萎縮,黏膜下層輕度增厚,漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞呈散在浸潤(rùn)。這說(shuō)明了該方劑治療胃炎有效。

TNF-α在致炎過(guò)程中起重要作用,與炎癥活動(dòng)性呈正相關(guān)[7]。IL-6作為前炎癥細(xì)胞因子,在炎癥反應(yīng)過(guò)程中起著重要的作用,是敏感反映機(jī)體炎癥和組織損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[8]。IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子作為重要的炎癥介質(zhì)參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)[9]。生理狀態(tài)下,人體液中TNF-α和 IL-6水平較低,但在病理狀態(tài)下,TNF-α和IL-6分泌量增加以及引起的各種炎癥因子的瀑布式釋放可導(dǎo)致炎癥反應(yīng),引起組織細(xì)胞損傷。

最新研究表明[10],白介素-1受體相關(guān)激酶 (IRAK)家族參與炎癥反應(yīng)和機(jī)體先天性免疫反應(yīng)過(guò)程,在炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要作用。目前研究表明,IRAK-1、IRAK-2、IRAK-4、IRAK-M是IRAK家族中的 4個(gè)成員。Rekhter等[11]研究也顯示,在HEK293細(xì)胞中過(guò)表達(dá)激酶失活型的IRAK-4與野生型相比,不能激活NF-κB,阻斷了IL-1和IL-8的產(chǎn)生。其中,IRAK-4是IRAK家族中最重要的一種激酶,它能激活核因子-κB(NF-κB),活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核,引起促炎細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),從而使各種炎性細(xì)胞因子表達(dá)升高[12]。因此,IRAK-4在炎癥信號(hào)通路和免疫反應(yīng)過(guò)程中的作用較家族其他激酶更為關(guān)鍵。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大建中湯能夠降低脾陽(yáng)虛胃炎模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α以及血液?jiǎn)魏思?xì)胞中IRAK-4 mRNA的水平,提示大建中湯治療胃炎脾陽(yáng)虛證的機(jī)制可能與降低IL-6、TNF-α、IRAK-4的水平有關(guān)。據(jù)此,大建中湯治療脾陽(yáng)虛胃炎有較大的發(fā)展前景,應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)該方治療炎癥的機(jī)制研究,并進(jìn)行深層次的開(kāi)發(fā)利用,以為臨床提供科學(xué)依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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