溫劍藝,王首紅,劉艷紅,張崇健,郭偉新

(廣東省人民醫(yī)院 廣東省醫(yī)學科學院,廣東 廣州 510080)

膿毒癥是重癥患者死亡的重要原因之一[1]。研究顯示[2]腸道組織是膿毒癥早期受累以及重度膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的靶器官之一,而腸道上皮細胞屏障功能障礙是多器官以及組織衰竭的“始動”因子。Guo等[3]研究顯示在膿毒癥小鼠模型中,核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號被激活,磷酸化NF-κB65 (NF-κB p65)的表達明顯升高,動物血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)等水平明顯升高,炎癥性應激加劇,患者腸道組織的免疫屏障標志物白細胞共同抗原(CD45)以及腸道上皮細胞機械屏障的標志物閉合蛋白1(Claudin-1)和閉鎖蛋白1(ZO-1)的表達明顯下降,動物結(jié)腸組織的病理損傷明顯加重。Xie等[4]研究指出,在膿毒癥患者中,炎癥性應激的晚期介質(zhì)高遷移率蛋白-1(HMGB1)以及核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)伴隨NF-κB p65的表達驟增是膿毒癥趨于惡性進展的標志性事件。四磨湯出自《濟生方》,主要由木香、枳殼、烏藥、檳榔四味中藥組成,在臨床上被稱作“胃腸動力劑”[5]。本研究以盲腸結(jié)扎穿孔術(CLP)模擬膿毒癥狀態(tài),構(gòu)建大鼠重度膿毒癥模型,從NF-κB信號入手,以NF-κB信號通路激活劑佛波酯(PMA)進行功能挽救實驗,探討四磨湯對重度膿毒癥大鼠結(jié)腸黏膜的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:SD大鼠,雄性,SPF級,50只,7～8周齡,體重220～250 g,購自廣東萊迪生物醫(yī)藥研究院有限公司,生產(chǎn)批號:SCXK(粵)2022-0064。在我院SPF級基礎動物房中,設定溫度(25±2)℃,濕度(45±5)%,12 h/12 h交替光暗周期的飼養(yǎng)條件下進行適應性喂養(yǎng)1周后用于實驗。

1.1.2 實驗試劑:NF-κB信號通路激活劑(PMA,美國Selleck公司),四磨湯口服液 (主要成分有木香、枳殼、烏藥、檳榔,湖南漢森制藥股份有限公司,規(guī)格:10 ml,國藥準字 Z20025044),多聚甲醛、二甲苯、無水乙醇等(武漢華美生物技術有限公司),兔抗大鼠NF-κB、兔抗大鼠NF-κB p65、兔抗大鼠三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、兔抗大鼠B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、兔抗大鼠Bcl-2相關X蛋白(Bax)單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司),蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(武漢凱基生物技術公司),末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導的脫氧尿苷三磷酸(dUTP)缺口末端標記(TUNEL)(北京中杉生物公司),免疫組化、免疫熒光、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)試劑盒(美國Bio-Rad公司),酶聯(lián)吸附試劑盒(上海生工生物工程技術有限公司)。

1.1.3 實驗儀器:超低溫冰箱(日本三洋公司),DYCP-31CN型瓊脂糖水平電泳儀以及凝膠成像系統(tǒng)(北京六一儀器廠),REBEL 2 IN 1正置/倒置Hybrid顯微鏡(美國Discover ECHO公司),Multiskan SkyHigh Microplate Spectrophotometer 酶標儀(美國賽默飛公司),Tundra 冷凍透射電子顯微鏡(Cryo-TEM) (荷蘭賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠重度膿毒癥模型建立:根據(jù)Bi等[6]介紹的方法通過CLP術構(gòu)建動物模型,腹腔注射45 mg/kg的戊巴比妥鈉將動物麻醉,無菌操作臺上,以仰臥位進行固定后,腹部備皮,沿腹正中線剪開約1 cm切口,移出腹腔中的盲腸,結(jié)扎其根部,在顯微鏡下,刺穿盲腸,擠壓盲腸,排出腸內(nèi)容物后,逐層關腹。

造模術后4 h,對實驗動物從毛發(fā)豎立、腹瀉、結(jié)膜炎以及昏睡程度進行行為學評分,每項評分如下:無,記為0分;輕度,記為1分;中度,記為2分;重度,記為3分,總分為12分,評分在6～12分視為造模成功[7]。

1.2.2 大鼠分組處理[8]:按照隨機數(shù)字表法將實驗動物分為正常組、模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組。其中模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠按照上述造模術進行造模,而正常組大鼠在造模過程中僅暴露盲腸即可。

造模成功后30 min,四磨湯低劑量組大鼠每日定時以7.56 ml/kg的四磨湯進行灌胃處理,并以0.9%氯化鈉溶液進行腹腔注射;四磨湯高劑量組大鼠每日定時以15.12 ml/kg的四磨湯進行灌胃處理,并以0.9%氯化鈉溶液進行腹腔注射;激活劑組每日定時大鼠以15.12 ml/kg的四磨湯進行灌胃處理的同時并以5 mg/kg的PMA進行腹腔注射;而正常組和模型組大鼠每日定時以等劑量的0.9%氯化鈉溶液進行灌胃處理和腹腔注射,各組大鼠單籠飼養(yǎng),自由飲水與攝食,連續(xù)給藥14 d。

1.3 實驗檢測指標

1.3.1 各組大鼠的一般狀況以及血清指標檢測:在實驗過程中,每日記錄大鼠的進食與飲水情況、精神狀態(tài)、活動量、皮毛狀態(tài)等日常行為參數(shù)。在末次給藥結(jié)束后,將大鼠禁食不禁水12 h,尾靜脈留取5 ml血液標本,離心后留取上清,按酶聯(lián)吸附試劑盒要求進行實驗操作,配置標準品溶液,終止反應,繪制標準曲線,酶標儀檢測血清中TNF-α和IL-6的含量。

1.3.2 各組大鼠結(jié)腸組織的病理學檢測:留取血液完畢,處死大鼠,顯微鏡下,逐層開腹,至暴露大鼠的結(jié)腸組織,在手術剪的幫助下,將大鼠的結(jié)腸組織取出,觀察各組大鼠結(jié)腸黏膜的狀態(tài)。將大腸結(jié)腸縱向剖開,觀察其宏觀損傷情況并進行評分:無充血、粘連,并且無水腫潰瘍點記為0分;局部出現(xiàn)水腫、粘連或充血記為1分,并且每增加1個充血灶點評分即增加1分[9]。之后,以4%多聚甲醛將結(jié)腸組織固定,包埋,切片,脫蠟,進行HE、PAS染色,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察大鼠結(jié)腸組織的病理損傷,統(tǒng)計每100個腸上皮細胞中杯狀細胞的數(shù)量。

1.3.3 各組大鼠結(jié)腸組織的細胞凋亡:取大鼠的結(jié)腸組織,常規(guī)固定,制成切片,按TUNEL試劑盒要求檢測各組大鼠結(jié)腸組織上皮細胞的凋亡情況,在顯微鏡下,凋亡的細胞呈現(xiàn)綠色熒光,正常細胞呈現(xiàn)藍色熒光。Image J圖像處理軟件進行統(tǒng)計分析[10]。

1.3.4 各組大鼠結(jié)腸組織中HMGB1和NLRP 的表達:取大鼠的結(jié)腸組織,多聚甲醛固定,BSA封閉,加入一抗(HMGB1和NLRP3的稀釋比例均為1∶100),在4 ℃下避光孵育過夜,充分清洗后,加入抗熒光二抗,防淬滅劑封片,鏡下觀察。

1.3.5 各組大鼠結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達:取大鼠的結(jié)腸組織,經(jīng)固定,切片,脫蠟,脫水,抗原修復,封閉后,依次加入一抗(兔抗CD45、ZO-1和Claudin-1的稀釋比例均為1∶200)、二抗(1∶1000),洗滌3次,常溫下復染、封片后,鏡下觀察,當出現(xiàn)棕黃色顆粒視為目標蛋白表達[11],結(jié)果判定:①按陽性細胞百分數(shù)評分,0分,陽性細胞數(shù)≤5%;1分,6%<陽性細胞數(shù)≤25%;2分,26%<陽性細胞數(shù)≤75%;3分,>76%。②按細胞著色強度評分,0分,無著色;1分,淡黃色;2分,棕黃色;3分,棕褐色;將兩項評分的乘積作為總評分。

1.3.6 各組大鼠結(jié)腸組織中NF-κB、NF-κB p65、Bcl-2和Bax的表達:取各組大鼠的結(jié)腸組織,通過RIPA裂解液提取樣本中的總蛋白,待測定其濃度后,進行加熱變性,取50 μg上樣,電泳分離,轉(zhuǎn)至PVDF膜上,封閉,加入兔抗大鼠NF-κB、NF-κB p65、Bcl-2和Bax一抗(各蛋白的稀釋比例均為1∶500),過夜,洗滌3次,二抗(1∶1500)稀釋后,室溫孵育,洗滌,顯影后,以GAPDH為參照[12],Image J軟件進行統(tǒng)計。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示,多組間比較采用單因素分析,兩組間比較采用SNK-q檢驗;P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的一般狀態(tài)和行為學評分比較 見表1。在實驗過程中,正常組大鼠精神狀態(tài)、運動量、皮毛、進食與飲水量、排泄以及肛周未見異常;模型組大鼠精神狀態(tài)萎靡,懶動,結(jié)膜炎嚴重,反應遲鈍,皮毛豎立且暗淡無光,進食與飲水減少,肉眼可見稀水樣便,肛周明顯不清潔;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組以及激活劑組的行為明顯改善,尤以四磨湯高劑量組大鼠改善的程度最為明顯。實驗結(jié)束時統(tǒng)計分析顯示,四磨湯能明顯改善重度膿毒癥大鼠的行為,而PMA能部分逆轉(zhuǎn)這一作用,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠行為學評分比較(分)

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織的解剖學、病理學、超微結(jié)構(gòu)損傷以及結(jié)腸黏膜杯狀細胞的變化 肉眼觀察結(jié)腸黏膜,正常組大鼠結(jié)腸黏膜光滑未見異常;模型組大鼠的結(jié)腸黏膜顏色偏暗,結(jié)腸黏膜變薄,明顯腫脹,可見明顯的充血灶點或出血條帶;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組以及激活劑組大鼠的結(jié)腸黏膜腫脹明顯減輕,充血灶點明顯減少或出血區(qū)域明顯減小,尤以四磨湯高劑量組最為明顯。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,與正常組大鼠比較,模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組結(jié)腸組織的宏觀評分明顯升高;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組結(jié)腸組織的宏觀評分明顯降低;與四磨湯低劑量組比較,四磨湯高劑量組結(jié)腸組織的宏觀評分明顯降低;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組結(jié)腸組織的宏觀評分明顯上升,差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織宏觀評分比較(分)

HE染色顯示,正常組大鼠結(jié)腸黏膜各層分層清晰,未見異常,腸微絨毛正常,大腸腺結(jié)構(gòu)清晰,分布豐富;模型組大鼠黏膜各層出現(xiàn)不同程度的水腫,炎性細胞大量浸潤,腸微絨毛或脫落或丟失,大腸腺明顯萎縮;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組以及激活劑組大鼠結(jié)腸黏膜損傷明顯改善,炎性浸潤明顯緩解,尤以四磨湯高劑量組大鼠結(jié)腸組織黏膜損傷明顯減輕(圖1)。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織損傷病理學表現(xiàn)(HE染色,×400)

腸道黏膜屏障的黏蛋白經(jīng)PAS染色后,呈酒杯狀的顆粒狀[13];本研究PAS結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組結(jié)腸組織中的杯狀細胞的數(shù)量明顯降低;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組結(jié)腸組織中的杯狀細胞的數(shù)量明顯升高;與四磨湯低劑量組比較,四磨湯高劑量組結(jié)腸組織中的杯狀細胞的數(shù)量明顯升高;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組結(jié)腸組織中的杯狀細胞的數(shù)量明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表3。

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織細胞凋亡率比較 見表4。TUNEL染色結(jié)果顯示,與正常組大鼠比較,模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結(jié)腸組織中的細胞凋亡率明顯升高;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結(jié)腸組織中的細胞凋亡率明顯降低;與四磨湯低劑量組比較,四磨湯高劑量組大鼠結(jié)腸組織中的細胞凋亡率明顯降低;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組結(jié)腸組織中的細胞凋亡率明顯上升,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織細胞凋亡率比較(%)

2.4 各組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量比較 見表5。酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測結(jié)果顯示,在模型組中,大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量明顯升高,四磨湯能明顯抑制大鼠血清中TNF-α和IL-6的分泌,PMA能部分逆轉(zhuǎn)這一作用,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表5 各組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量比較(ng/L)

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織中HMGB1和NLRP3水平比較 見表6。免疫熒光檢測HMGB1和NLRP3的表達結(jié)果顯示,模型組結(jié)腸組織中HMGB1和NLRP3的表達明顯升高;四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結(jié)腸組織中HMGB1和NLRP3的表達明顯降低;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組結(jié)腸組織中HMGB1和NLRP3的表達明顯升高,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表6 各組大鼠結(jié)腸組織中HMGB1和NLRP3水平比較

2.6 各組大鼠結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1表達比較 見表7(圖2)。免疫組化結(jié)果顯示,與正常組大鼠比較,模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達明顯降低;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達明顯升高;與四磨湯低劑量組比較,四磨湯高劑量組大鼠結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達明顯升高;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組大鼠結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達明顯降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1表達比較(免疫組化染色,×400)

表7 各組大鼠結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1免疫組化評分比較(分)

2.7 各組大鼠結(jié)腸組織中NF-κB、NF-κB p65、Bcl-2和Bax水平比較 見表8。Western blot結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結(jié)腸組織中Bcl-2的表達明顯降低,NF-κB p65、Bax的表達明顯升高;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結(jié)腸組織中Bcl-2的表達明顯升高,NF-κB p65、Bax的表達明顯降低;與四磨湯低劑量組比較,四磨湯高劑量組大鼠結(jié)腸組織中Bcl-2的表達明顯升高,NF-κB p65、Bax的表達明顯降低;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組大鼠結(jié)腸組織中Bcl-2的表達明顯降低,NF-κB p65、Bax的表達明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

表8 各組大鼠結(jié)腸組織中NF-κB、NF-κB p65、Bcl-2和Bax水平比較

3 討 論

膿毒癥是累及肺、肝、腎、心、腦、腸等器官和組織的炎癥反應綜合征,腸道上皮損傷是重度膿毒癥的重要因素之一[14]。因此深入闡明腸道上皮屏障損傷的分子機制,在該領域中具有重大意義。

膿毒癥在中醫(yī)學中隸屬于“疽毒內(nèi)陷”“外感熱病”等范疇,機體因“正虛毒損,脈絡失司”以至于熱、虛、毒、瘀橫行脈絡,主要在“益氣溫陽、清熱解毒、扶正祛邪、活血化瘀”的指導下形成了參附注射液、清熱解毒方、香砂六君子湯、四磨湯、參白解毒方等名方用于臨床上膿毒癥的治療,顯示了較為穩(wěn)定的療效[15]。四磨湯為理氣扶陽的代表藥方,由木香、枳殼、烏藥、檳榔組成?，F(xiàn)代藥理學研究顯示[16],四磨湯以及其活性組分具有良好的抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、臟器保護以及調(diào)節(jié)胃腸動力的作用。Yi等[17]研究顯示在脾虛型便秘小鼠模型中,四磨湯能調(diào)控實驗動物結(jié)腸黏膜組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達,緩解動物結(jié)腸黏膜組織的病理損傷。周慧等[18]研究顯示在心力衰竭大鼠模型中,四磨湯的應用能明顯抑制動物體內(nèi)炎癥性應激的級聯(lián)放大,下調(diào)動物血清中TNF-α和IL-6的水平。本研究中以CLP構(gòu)建大鼠膿毒癥模型后,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜組織中的細胞凋亡率明顯下降,結(jié)腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達升高,而HMGB1和NLRP3的表達降低,結(jié)腸組織病理損傷,結(jié)腸黏膜的黏膜蛋白損傷均明顯減輕,證實四磨湯對疾病的干預作用。

腸道黏膜組織是機體抵御有害物質(zhì)和病原微生物入侵的第一道防線。NF-κB信號是炎癥性應激的關鍵通路之一,在膿毒癥發(fā)生后,NF-κB被激活,NF-κB p65的表達升高,攜帶炎性信號入核,一方面能促進TNF-α和IL-6的分泌以及釋放,炎癥性應激呈現(xiàn)級聯(lián)放大的“瀑布樣”[19],另一方面促進晚期炎癥介質(zhì)HMGB1和NLRP3的表達,推動炎癥性應激的進一步放大[20];同時誘導細胞中Bax表達的升高,下調(diào)Bcl-2的表達,誘使細胞凋亡,結(jié)腸黏膜損傷加劇[21]。本研究中以NF-κB信號激活劑PMA進行功能挽救,結(jié)果顯示PMA能部分逆轉(zhuǎn)四磨湯對結(jié)腸黏膜的修復作用,證實四磨湯通過抑制NF-κB信號而發(fā)揮作用。

綜上所述,四磨湯能明顯抑制重度膿毒癥大鼠結(jié)腸上皮細胞的炎癥應激狀態(tài),緩解結(jié)腸組織的病理損傷,改善結(jié)腸黏膜的屏障功能,這可能與抑制NF-κB信號的磷酸化有關。但是四磨湯是否還通過調(diào)控其他信號影響疾病的進展,仍需更為深入地研究。