左永杰,許孟月,李 斌,祖麗婭·吐爾地, 姚文匯,劉紅霞

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830000;2. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830000)

銀屑病是一種遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)、免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病,與易感基因、皮膚屏障損傷和免疫異常等有關(guān),臨床上表現(xiàn)為邊界清楚的紅斑、丘疹和斑塊,上覆銀白色鱗屑[1-2]。皮膚屏障損傷后,表皮細(xì)胞過度增殖、角化不全以及真皮層的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)會(huì)進(jìn)一步損害皮膚屏障功能,使得肌膚失養(yǎng),病情加重、反復(fù)[3]。目前研究認(rèn)為水通道蛋白3(AQP3)與銀屑病發(fā)病密切相關(guān),銀屑病皮損組織中AQP3表達(dá)減少,促使患者皮膚處于缺水狀態(tài),皮膚表現(xiàn)為干燥失養(yǎng),皮膚屏障功能下降[4]。首屆岐黃學(xué)者劉紅霞教授結(jié)合新疆的氣候、飲食及證候特點(diǎn),提出“健脾祛濕法”治療銀屑病的學(xué)術(shù)思想[5-6],以法類方的“健脾解毒湯”治療銀屑病取得良好的臨床療效。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn),健脾解毒湯可以促進(jìn)脾虛濕盛證銀屑病小鼠表皮顆粒層細(xì)胞分化,抑制其有絲分裂[7-8];可改善銀屑病皮損,緩解“肌膚甲錯(cuò)”癥狀,其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群、JAKs/STATs通路及炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)水平有關(guān)[9-10]。本研究基于皮膚屏障功能,探討了健脾解毒湯是否通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/p38絲裂原活化蛋白激酶(ERK/p38MAPK) 信號(hào)通路調(diào)控脾虛濕盛證銀屑病大鼠皮膚組織AQP3的表達(dá)而發(fā)揮治療作用,以進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠144只,6～8周齡,體重180～200 g,由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(新)2018-0001。采用新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供的標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料常規(guī)分籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度(23±3)℃,相對(duì)濕度40%～70%,自然光照,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2主要藥物 健脾解毒湯,由土茯苓30 g、綿萆薢10 g、黃柏10 g、苦參10 g、連翹30 g、生薏苡仁30 g、茯苓10 g、炒白術(shù)10 g、白花蛇舌草30 g、丹參10 g、炙甘草6 g組成,水煎劑由新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院制劑室提供。大黃配方顆粒劑,江陰天江藥業(yè)有限公司,3 g/袋。咪喹莫特乳膏,四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字H20030128。

1.3主要試劑及儀器 p38MAPK抑制劑(SB203580,美國(guó)MCE公司,批號(hào):HY-10256)、ERK1/2通路抑制劑(U0126,美國(guó)MCE公司,批號(hào):HY-12031);蘇木素染液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,批號(hào):CTS-1097);伊紅染液、中性樹膠(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號(hào)分別為ZLI-9613、ZLI-9555);RIPA裂解液(博士德生物,批號(hào):AR0105);蛋白酶抑制劑(博士德生物,批號(hào):AR1178);山羊抗兔IgG H&L(HRP,Abcam,批號(hào):ab205718);山羊抗小鼠IgG H&L(HRP,Abcam,批號(hào):ab205719);PVDF Transfer Membrane(0.45 μm)(Millipore,批號(hào):IPVH00010);SuperSignalTMWest Pico PLUS Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher,批號(hào):34580);beta-Actin Loading Control antibody Mouse MAb(義翹神州,批號(hào):100166-MM10);Anti-Aquaporin3抗體、Anti-ERK1 + ERK2抗體、Anti-ERK1(phospho T202)+ ERK2 (phospho T185)抗體、Anti-p38 alpha/MAPK14抗體、Anti-p38(phospho T180 + Y182)抗體(abcam,批號(hào)依次為ab125219、ab184699、ab201015、ab170099、ab4822)。手動(dòng)單道移液器(德國(guó)Eppendorf公司,批號(hào):Research plus);電子天平(Germany Sartorius,批號(hào):CP324S);臺(tái)式低速離心機(jī)(上海飛鴿儀器有限公司 ,批號(hào):TGL-16GB);酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad xMarkTM);凝膠成像系統(tǒng)(上海天能2500)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、甲氨蝶呤組、健脾解毒湯低劑量組、健脾解毒湯中劑量組、健脾解毒湯高劑量組、健脾解毒湯低劑量+ERK抑制劑組、健脾解毒湯中劑量+ERK抑制劑組、健脾解毒湯高劑量+ERK抑制劑組、健脾解毒湯低劑量+MAPK抑制劑組、健脾解毒湯中劑量+MAPK抑制劑組、健脾解毒湯高劑量+MAPK抑制劑組,每組12只。除空白組外,其余組大鼠先參考文獻(xiàn)[11]方法建立銀屑病樣皮損模型:大鼠背部備皮,范圍3 cm×3 cm,將5%咪喹莫特62.5 mg局部涂抹于背部剃光的皮膚處,連續(xù)涂抹10 d;然后依據(jù)“苦寒之藥損其脾胃”觀點(diǎn),參考文獻(xiàn)[7]建立脾虛濕盛證模型:1 g/mL大黃配方顆粒劑 10 mL/(kg·次)灌胃,2次/d,連續(xù)10 d。造模結(jié)束后,按照《中藥藥理研究方法學(xué)》[12]中由人和動(dòng)物的體表面積計(jì)算法計(jì)算出的給藥劑量,甲氨蝶呤組給予甲氨碟呤片0.97 mg/kg灌胃;健脾解毒湯低、中、高劑量組分別給予2.32 g/kg、4.64 g/kg、9.26 g/kg 健脾解毒湯灌胃;健脾解毒湯低、中、高劑量+ERK抑制劑各組均給予20 μg的U0126腹腔注射,同時(shí)給予相應(yīng)劑量的健脾解毒湯灌胃;健脾解毒湯低、中、高劑量+MAPK抑制劑各組均給予3 mg/kg的SB203580腹腔注射,同時(shí)給予相應(yīng)劑量的健脾解毒湯灌胃;空白組和模型組給予等量的生理鹽水灌胃和腹腔注射。灌胃和腹腔注射均1次/d,連續(xù)14 d。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1皮膚狀態(tài) 觀察各組大鼠背部皮膚狀態(tài)并拍照。

1.5.2皮膚組織病理形態(tài) 末次灌胃結(jié)束后處死各組大鼠,收集背部皮損組織,用固定液固定組織標(biāo)本,常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色后在光鏡下觀察皮損組織病理形態(tài)。

1.5.3皮損組織中AQP3、ERK1/2、p-ERK1/2、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):取出保存在液氮中的皮膚組織,經(jīng)液氮研磨后,將約150 mg皮膚組織加入到預(yù)冷的1.5 mL離心管中,然后加入300 μL RIPA裂解液,充分混勻,4 ℃放置60 min后,4 ℃下12 000 r/min離心15 min,收集上清液。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度,進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉,加入AQP3(1∶1000)、ERK1+2(1∶1 000)、p-ERK1+2(1∶600)、p38MAPK(1∶1 000)、p-p38 MAPK(1∶800)、β-actin(1∶1 000)一抗,4 ℃孵育過夜,加入二抗,室溫下孵育1 h,ECL法顯色,以β-actin為內(nèi)參蛋白,運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)分析灰度值,計(jì)算空白組、模型組、甲氨蝶呤組、健脾解毒湯低劑量組、健脾解毒湯中劑量組、健脾解毒湯高劑量組、健脾解毒湯高劑量+ERK抑制劑組、健脾解毒湯高劑量+MAPK抑制劑組各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料多組比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠灌胃結(jié)束后背部皮膚狀態(tài) 空白組大鼠背部皮膚未見紅斑鱗屑;模型組大鼠背部皮膚可見紫紅色斑塊,表皮肥厚隆起,較厚鱗屑;甲氨蝶呤組和健脾解毒湯低、中、高劑量組大鼠背部皮膚可見淡紅色斑塊,細(xì)碎鱗屑;健脾解毒湯低劑量+ERK抑制劑組、健脾解毒湯中劑量+ERK抑制劑組、健脾解毒湯低劑量+MAPK抑制劑組、健脾解毒湯中劑量+MAPK抑制劑組大鼠背部皮膚可見深紅色斑塊,表皮微隆起,片狀鱗屑;健脾解毒湯高劑量+ERK抑制劑組、健脾解毒湯高劑量+MAPK抑制劑組大鼠背部皮膚可見淡紅斑,無明顯鱗屑,皮損與正常平齊。見圖1。

2.2各組大鼠皮膚組織病理學(xué)形態(tài) 空白組表皮未見明顯增生,角質(zhì)層較薄,表皮突平坦,真皮層內(nèi)少量慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn),無明顯血管擴(kuò)張;模型組表皮增生肥厚,顯著角化不全伴角化過度,表皮突延長(zhǎng),部分表皮細(xì)胞間水腫,表皮內(nèi)及角質(zhì)層內(nèi)較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),真皮淺層內(nèi)血管擴(kuò)張,慢性炎細(xì)胞散在或灶狀浸潤(rùn);與模型組比較,各藥物組皮膚組織病變程度均減輕,健脾解毒湯高劑量組、健脾解毒湯高劑量+ERK抑制劑組、健脾解毒湯高劑量+MAPK抑制劑組的皮膚組織病變程度均顯著減輕,且健脾解毒湯高劑量+ERK抑制劑組、健脾解毒湯高劑量+MAPK抑制劑組病變程度稍輕于健脾解毒湯高劑量組。見圖2。

2.3各組大鼠皮膚組織中AQP3、ERK/P38 MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與空白組比較,模型組AQP3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P均<0.05),p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05);與模型組比較,甲氨蝶呤組、健脾解毒湯低劑量組、健脾解毒湯中劑量組、健脾解毒湯高劑量組、健脾解毒湯高劑量+ERK抑制劑組、健脾解毒湯高劑量+MAPK抑制劑組AQP3蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05),p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05);且健脾解毒湯高劑量+ERK抑制劑組、健脾解毒湯高劑量+MAPK抑制劑組AQP3蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于其他藥物組(P均<0.05),健脾解毒湯高劑量+ERK抑制劑組、健脾解毒湯高劑量+MAPK抑制劑組p-p38 MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于其他藥物組(P均<0.05),健脾解毒湯高劑量組、健脾解毒湯高劑量+ERK抑制劑組、健脾解毒湯高劑量+MAPK抑制劑組p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于甲氨蝶呤組、健脾解毒湯低劑量組、健脾解毒湯中劑量組(P均<0.05),且健脾解毒湯高劑量+ERK抑制劑組p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于健脾解毒湯高劑量+MAPK抑制劑組和健脾解毒湯高劑量組(P均<0.05)。見圖3及圖4。

3 討 論

健脾解毒湯是劉紅霞教授臨證多年治療銀屑病的經(jīng)驗(yàn)方,方中土茯苓、萆薢為君,共同發(fā)揮祛濕解毒通絡(luò)之功;白術(shù)、茯苓、薏苡仁為臣,三藥相使為用,一燥一滲,運(yùn)利結(jié)合,使水濕除而脾氣健;白花蛇舌草、連翹、黃柏、苦參及丹參為佐藥,合用共奏清熱解毒、燥濕止癢之功;甘草藥性平和,通行十二經(jīng)脈,可解毒、補(bǔ)虛、調(diào)和諸藥,為使藥;全方配伍剛?cè)嵯酀?jì),散收同施,共奏健脾解毒、潤(rùn)燥止癢之效,且健脾益氣除濕而不傷津。既往臨床研究表明,健脾解毒湯可有效治療脾虛濕盛證尋常型銀屑病[9,13]。

銀屑病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,近年來研究發(fā)現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生和分化、皮膚屏障功能受損刺激炎癥因子釋放等皮膚屏障功能失調(diào)因素均參與了銀屑病的發(fā)生發(fā)展,其中各種表皮結(jié)構(gòu)蛋白如AQP3作為維持皮膚屏障功能的主要生化結(jié)構(gòu)與銀屑病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,脾虛濕盛證銀屑病樣大鼠皮膚組織出現(xiàn)明顯病理改變,皮膚組織中AQP3蛋白呈現(xiàn)異常低表達(dá);不同劑量健脾解毒湯干預(yù)后,大鼠皮膚病變程度均減輕,皮膚組織中AQP3蛋白表達(dá)量明顯上調(diào),且健脾解毒湯高劑量組改善更明顯。提示健脾解毒湯改善脾虛濕盛證銀屑病樣大鼠皮膚組織屏障功能的作用與上調(diào)皮膚組織中水通道蛋白的表達(dá)有關(guān)。

圖1 空白組和銀屑病各組大鼠灌胃結(jié)束后取樣前背部皮膚表現(xiàn)

MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞中炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵通路,具有將細(xì)胞外的刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi),并引起細(xì)胞應(yīng)激、分化、增殖、凋亡的作用[15]。ERK1/2、p38MAPK是MAPK信號(hào)通路的重要成員,分別具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)與分化和調(diào)節(jié)炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)的作用[16]。有研究表明,AQP的表達(dá)與MAPK信號(hào)通路的激活密切相關(guān)[17-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),脾虛濕盛證銀屑病樣大鼠皮膚組織中p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白異常高表達(dá),不同劑量健脾解毒湯干預(yù)可不同程度地下調(diào)p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白表達(dá),其中高劑量健脾解毒湯干預(yù)后p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白下調(diào)更明顯。而高劑量健脾解毒湯分別與p38MAPK抑制劑和ERK1/2通路抑制劑聯(lián)合作用后,p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白表達(dá)進(jìn)一步下調(diào),AQP3蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào),提示ERK/p38MAPK信號(hào)通路參與了健脾解毒湯對(duì)脾虛濕盛證銀屑病樣大鼠皮膚組織AQP3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述,脾虛濕盛證銀屑病樣大鼠出現(xiàn)明顯皮膚屏障功能異常,健脾解毒湯能夠通過抑制ERK/p38 MAPK信號(hào)通路的激活而上調(diào)脾虛濕盛證銀屑病樣大鼠皮膚組織中AQP3蛋白表達(dá),促進(jìn)皮膚的水合作用,從而改善皮膚的干燥程度,修復(fù)皮膚的屏障功能。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了健脾方藥具有修復(fù)皮膚屏障功能的作用,但由于中藥具有多組分、多通路、多靶點(diǎn)作用等特點(diǎn),仍需對(duì)其有效成分及作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

圖2 空白組和銀屑病各組大鼠皮膚組織病理學(xué)形態(tài)(HE染色)

圖3 空白組和銀屑病各組大鼠皮膚組織中AQP3、ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白印跡圖

圖4 空白組和銀屑病各組大鼠皮膚組織中AQP3、ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。