吳 琳 張渭波 行艷麗 李 艷 趙美峰 姚 歡

1.陜西省咸陽(yáng)市中心醫(yī)院藥學(xué)部，陜西咸陽(yáng) 712000；2.陜西省咸陽(yáng)市中心醫(yī)院病理科，陜西咸陽(yáng) 712000

陽(yáng)和湯出自清代王維德的《外科證治全生集》[1]，由麻黃、肉桂、鹿角膠、熟地、炮姜炭、白芥子、生甘草組成，具有溫陽(yáng)散寒、活血通絡(luò)、化痰散結(jié)的功效，是治療陰疽的經(jīng)典效方。陰疽病變部位往往堅(jiān)硬如石且漫腫不紅，多為陰痰郁滯氣血、阻隔經(jīng)絡(luò)所致，相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的腫瘤[2-3]。近年來(lái)，陽(yáng)和湯廣泛應(yīng)用于腫瘤的臨床治療[4-5]，相關(guān)研究[6-7]顯示，其在腫瘤治療領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。有研究顯示，陽(yáng)和湯治療腫瘤的具體病種中，肺癌的使用頻率位居第二，僅次于乳腺癌，占比為28.6%[8]。隨著研究的深入，腫瘤免疫微環(huán)境已被視為腫瘤的“第七大標(biāo)記性特征”，在腫瘤形成及進(jìn)展中發(fā)揮著非常重要的作用[9-10]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境方面具有重要的作用[11-12]，因此本研究擬觀察陽(yáng)和湯對(duì)Lewis 肺癌荷瘤小鼠的抑瘤效應(yīng)，對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境中白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transformed growth factor-β，TGF-β）的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory cell，Treg）的影響，以期為陽(yáng)和湯治療肺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

一月齡SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠50 只，雄性，體重18～22 g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（陜）2018-001，合格證號(hào)410021003105 279。飼養(yǎng)在陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房（溫度22～27℃，相對(duì)濕度45%～66%），小鼠可自由飲水并攝取食物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。小鼠Lewis 肺癌細(xì)胞株購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

陽(yáng)和湯由熟地30 g、鹿角膠9 g、白芥子6 g、肉桂3 g、生甘草3 g、麻黃2 g、炮姜炭2 g 組成，藥材均購(gòu)于西安中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定學(xué)教研室鑒定，按上述劑量稱取，根據(jù)常規(guī)方法煎煮（鹿角膠打粉烊化），濃縮至2.75、1.84、0.92 g/ml 的藥液，置于4℃冰箱備用。環(huán)磷酰胺片（50 mg/片）購(gòu)于通化茂祥制藥有限公司（201902）。

1.3 主要試劑

Rabbit anti-mouse IL-2（江蘇親科生物研究中心有限公司，AF5105）；Rabbit anti-mouse TGF-β（博士德生物工程有限公司，BA0290）；Rabbit anti-mouse CD3（江蘇親科生物研究中心有限公司，DF6594）；Rabbit anti-mouse CD25（江蘇親科生物研究中心有限公司，DF7132）；Rabbit anti-mouse CD4（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，BF0174）；Rabbit anti-mouse CD8（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，EC6872）；Rabbit anti-mouse FoxP3（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，AF6544）；Rabbit IgG-SABC-FITC kit（江蘇親科生物研究中心有限公司，S0011）；DAPI 染色液（博士德生物工程有限公司，AR1176）。

1.4 儀器設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermoe scientifican 公司，CCB-150 型）；離心機(jī)（德國(guó)Eppendorph 公司，Centrifuge 5427R）；電子精密天平（德國(guó)Sartorius 公司，bsa423s，精度0.01 g）；石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司，RM2235）；生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司，TC-120S）；自動(dòng)恒溫烘片儀（湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司，TK-213）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

將培養(yǎng)濃度為2×107/ml Lewis 肺癌細(xì)胞懸液0.2 ml分別接種在適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d 后的50 只雄性C57BL/6小鼠右側(cè)前腋皮下以形成Lewis 肺癌荷瘤模型。按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為荷瘤模型組、環(huán)磷酰胺組、陽(yáng)和湯高劑量組、陽(yáng)和湯中劑量組和陽(yáng)和湯低劑量組，每組10 只。造模5 d 后用手觸摸到接種部位有結(jié)節(jié)提示造模成功，分別用生理鹽水、環(huán)磷酰胺（25 mg/kg）、陽(yáng)和湯高劑量（27.5 g/kg）、陽(yáng)和湯中劑量（18.3 g/kg）、陽(yáng)和湯低劑量（9.2 g/kg）進(jìn)行灌胃給藥，0.2 ml/次，1 次/d，連續(xù)10 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 小鼠的體重、瘤重及抑瘤率 首次給藥前及末次給藥后的第2 天分別稱量各組小鼠的體重；末次給藥后的第2 天脫頸處死小鼠剝離右側(cè)前腋下的瘤塊并稱取重量，并計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（荷瘤模型組平均腫瘤重量-實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤重量）/荷瘤模型組平均腫瘤重量×100%。

1.6.2 Lewis 肺癌組織中IL-2、TGF-β 的表達(dá) 對(duì)剝離并稱重后的腫瘤組織采用免疫組化法檢測(cè)IL-2和TGF-β 的表達(dá)，具體操作嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行。通過(guò)Image-Pro Plus 6.0 軟件測(cè)量IOD/Area，并進(jìn)一步對(duì)腫瘤組織中表達(dá)的IL-2、TGF-β 進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量分析。

1.6.3 Lewis 肺癌組織中CTL 和Treg 的標(biāo)志物CD3+CD8+與CD4+Foxp3+表達(dá)情況 對(duì)剝離并稱重后的腫瘤組織采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)CTL 和Treg 的標(biāo)志物CD3+CD8+與CD4+Foxp3+表達(dá)，具體操作嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行。結(jié)果判讀方法：在紫外光的激發(fā)下DAPI 染出的細(xì)胞核為藍(lán)色，相對(duì)熒光素標(biāo)記的紅色光為其陽(yáng)性表達(dá)，通過(guò)Image J 軟件做最后處理。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重、瘤重及抑瘤率比較

用藥前，各組小鼠體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。用藥后，與荷瘤模型組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠體重降低（P <0.01），陽(yáng)和湯高、中劑量組小鼠體重增加（P <0.05 或P <0.01）；與環(huán)磷酰胺組比較，陽(yáng)和湯高、中、低劑量組小鼠體重增加（P <0.01）；與陽(yáng)和湯高劑量組比較，陽(yáng)和湯低劑量組小鼠體重降低（P <0.05）。與荷瘤模型組比較，環(huán)磷酰胺組、陽(yáng)和湯高劑量組小鼠瘤重降低（P <0.05 或P <0.01）；與環(huán)磷酰胺組比較，陽(yáng)和湯中、低劑量組小鼠瘤重增加（P <0.05）；陽(yáng)和湯高劑量組小鼠瘤重與環(huán)磷酰胺組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。抑瘤率由高到底分別為環(huán)磷酰胺組、陽(yáng)和湯高劑量組、陽(yáng)和湯中劑量組、陽(yáng)和湯低劑量組。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠體重、瘤重及抑瘤率比較

2.2 各組小鼠Lewis 肺癌組織中IL-2、TGF-β 表達(dá)比較

IL-2 和TGF-β 的表達(dá)位于細(xì)胞間質(zhì)，呈黃色或棕黃色，見(jiàn)圖1～2。與荷瘤模型組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠Lewis 肺癌組織IL-2 表達(dá)降低（P <0.01），陽(yáng)和湯高、中、低劑量組小鼠Lewis 肺癌組織IL-2 表達(dá)增加（P <0.05 或P <0.01）；與環(huán)磷酰胺組比較，陽(yáng)和湯高、中、低劑量組小鼠Lewis 肺癌組織IL-2 表達(dá)增加（P <0.01）；與陽(yáng)和湯高劑量組比較，陽(yáng)和湯中、低劑量組小鼠Lewis 肺癌組織IL-2 表達(dá)降低（P <0.01）。與荷瘤模型組比較，環(huán)磷酰胺組，陽(yáng)和湯高、中劑量組小鼠Lewis 肺癌組織TGF-β 表達(dá)降低（P <0.01）；與環(huán)磷酰胺組比較，陽(yáng)和湯中、低劑量組小鼠Lewis肺癌組織TGF-β 表達(dá)增加（P <0.05）。見(jiàn)表2。

圖1 小鼠Lewis 肺癌組織中IL-2 免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果

圖2 小鼠Lewis 肺癌組織中TGF-β 免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果

圖3 小鼠Lewis肺癌組織中CD3+CD8+免疫熒光結(jié)果

表2 各組小鼠Lewis 肺癌組織中IL-2、TGF-β 表達(dá)比較（）

表2 各組小鼠Lewis 肺癌組織中IL-2、TGF-β 表達(dá)比較（）

注：與荷瘤模型組比較，aP ＜0.05、bP ＜0.01；與環(huán)磷酰胺組比較，cP ＜0.05、dP ＜0.01；與陽(yáng)和湯高劑量組比較，eP ＜0.01。IL-2：白細(xì)胞介素-2；TGF-β：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β

2.3 各組小鼠Lewis 肺癌組織中CD3+CD8+與CD4+Foxp3+表達(dá)比較

免疫熒光檢測(cè)中，陽(yáng)和湯高劑量組CD3+CD8+的熒光強(qiáng)度強(qiáng)、密度最大；環(huán)磷酰胺組CD4+Foxp3+密度最小，其次是陽(yáng)和湯高劑量組。見(jiàn)圖3～4（封四）。與荷瘤模型組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠Lewis 肺癌組織CD3+CD8+表達(dá)降低（P <0.01），陽(yáng)和湯高、中、低劑量組小鼠Lewis 肺癌組織CD3+CD8+表達(dá)增加（P<0.05 或P <0.01）；與環(huán)磷酰胺組比較，陽(yáng)和湯高、中、低劑量組小 鼠Lewis 肺癌組織CD3+CD8+表達(dá)增加（P <0.01）。與陽(yáng)和湯高劑量組比較，陽(yáng)和湯中、低劑量組小鼠Lewis 肺癌組織CD3+CD8+表達(dá)降低（P <0.01）。與荷瘤模型組比較，環(huán)磷酰胺組，陽(yáng)和湯高、中劑量組小鼠Lewis肺癌組織CD4+Foxp3+表達(dá)降低（P <0.05 或P<0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠Lewis 肺癌組織中CD3+CD8+與CD4+Foxp3+表達(dá)比較（）

表3 各組小鼠Lewis 肺癌組織中CD3+CD8+與CD4+Foxp3+表達(dá)比較（）

注：與荷瘤模型組比較，aP ＜0.05、bP ＜0.01；與環(huán)磷酰胺組比較，cP ＜0.01；與陽(yáng)和湯高劑量組比較，dP ＜0.01

3 討論

Stephen Paget 在1889 年提出的“種子與土壤”假說(shuō)，為腫瘤微環(huán)境概念的提出奠定了基礎(chǔ)[13]。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞形成和增殖過(guò)程中所依賴的生長(zhǎng)環(huán)境，是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[14-15]，是機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要場(chǎng)所，是抗腫瘤免疫的重要部分[16-17]。其中由免疫相關(guān)細(xì)胞和因子及其他活性成分構(gòu)成的“腫瘤免疫微環(huán)境”影響著腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[18-19]。在腫瘤免疫微環(huán)境中，CTL 在抗腫瘤免疫應(yīng)答中對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高度特異性和殺傷效應(yīng)，與自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞共同發(fā)揮抗腫瘤作用[20]，該細(xì)胞主要標(biāo)志物為CD3+CD8+。IL-2 又稱T 細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)CTL 和NK 細(xì)胞活化和增殖[21-22]，介導(dǎo)抗腫瘤的細(xì)胞毒效應(yīng)。Treg 是一類具有免疫抑制功能的CD4+T 細(xì)胞功能亞群，其中表達(dá)CD4+Foxp3+的Treg 通過(guò)產(chǎn)生TGF-β 等細(xì)胞因子對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境發(fā)揮免疫抑制作用[23-24]。同時(shí)TGF-β 又可誘導(dǎo)Treg 細(xì)胞的擴(kuò)增[25]。

環(huán)磷酰胺的細(xì)胞毒性免疫抑制雖然有顯著的抑瘤效應(yīng)，但能降低荷瘤小鼠體重和腫瘤免疫微環(huán)境中IL-2、TGF-β 表達(dá)及CTL、Treg 的含量。高劑量陽(yáng)和湯在抑瘤效應(yīng)方面與環(huán)磷酰胺比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），且不影響荷瘤小鼠的體重，并能促進(jìn)腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的IL-2 表達(dá)和CTL 增加，降低腫瘤免疫微環(huán)境中具有抑制作用的TGF-β表達(dá)及Treg 的含量。陽(yáng)和湯中、低劑量的抑瘤效應(yīng)不是很明顯，但在調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境中IL-2、TGF-β的表達(dá)和CTL、Treg 的含量方面發(fā)揮著一定的作用，且不影響荷瘤小鼠的體重。本研究結(jié)果顯示，陽(yáng)和湯對(duì)荷瘤小鼠的Lewis 肺癌組織具有一定的抑制作用。其抑制腫瘤的機(jī)制可能與影響腫瘤免疫微環(huán)境中IL-2、TGF-β 表達(dá)及CTL、Treg 的含量有關(guān)。應(yīng)進(jìn)一步開(kāi)展陽(yáng)和湯對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫相關(guān)細(xì)胞和因子及其它活性成分的影響研究，以深入探討其抑瘤作用機(jī)制。