魏騰 高瑩 曹青日

[摘要] 目的 建立恩替卡韋反相高效液相色譜（RP-HPLC）分析方法，測定口腔速溶膜劑中藥物含量。 方法 以聚乙烯醇/聚乙二醇接枝共聚物為成膜材料，溶劑澆注法制備恩替卡韋口腔速溶膜劑。采用Inertsil ODS-3 C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-水（3∶97）和乙腈為流動相A和流動相B，檢測波長254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，進樣量20 μL，利用梯度洗脫程序測定恩替卡韋口腔速溶膜劑中藥物含量。 結(jié)果 恩替卡韋標準溶液線性回歸方程為：A=52548.1316C-639.5153 （R2=0.9999），日內(nèi)精密度為0.15%～0.56%，日間精密度為0.35%～1.36%，準確度為99.70%，定量限為0.31 ng，檢測限為0.26 ng，且藥物溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。恩替卡韋口腔速溶膜劑中藥物含量為（98.93±0.55）%。 結(jié)論 本研究RP-HPLC分析方法專屬性強，精密度、準確度高，穩(wěn)定性好，適用于恩替卡韋口腔速溶膜劑中藥物含量測定。

[關(guān)鍵詞] 反相高效液相色譜；恩替卡韋；口腔速溶膜劑；聚乙烯醇/聚乙二醇接枝共聚物；含量測定

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）02（c）-0019-05

Determination of drug content in entecavir-loaded orodispersible film by a reverse phase high performace liqiud chromatography

WEI Teng1 GAO Ying2 CAO Qingri1

1.College of Pharmaceutical Sciences， Soochow University， Jiangsu Province， Suzhou 215123， China； 2.MSD R&D; （China） Co.， LTD.， Beijing 100000， China

[Abstract] Objective To establish a reverse phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC） method for the determination of drug content in entecavir-loaded orodispersible films （ODFs）. Methods The entecavir-loaded ODFs were prepared by using a solvent casting method with polyvinyl alcohol/polyethylene glycol graft copolymer as a film-forming agent. The RP-HPLC analysis was performed on an Inertsil ODS-3 C18 （4.6 mm×150 mm， 5 μm） column with mobile phases composed of acetonitrile-water （3∶97） and acetonitrile. The flow rate of mobile phase was 1.0 mL/min. The wavelength of UV detector was set at 254 nm and the injection volume was 20 μL. The column temparature was mantained at 25℃. The drug content of entecavir-loaded ODFs was analyzed by a gradient elution mode. Results The linear regression equation of entecavir standard solution was A=52548.1316C-639.5153 （R2=0.9999）. The intra-day precision was 0.15%-0.56%， the inter-day precision was 0.35%-1.36%， and the accuracy was 99.70%. The limit of detection was 0.31 ng and the limit of quantitation was 0.28 ng. The drug solution was stable within 24 h. The drug content of entecavir-loaded ODFs was （98.93±0.55）%. Conclusion The RP-HPLC method of entecavir shows high specificity， good precision， accuracy， and stability. This method is suitable for the detemination of drug content in entecavir-loaded ODFs.

[Key words] RP-HPLC； Entecavir； Orodispersible films； Polyvinyl alcohol/polyethylene glycol graft copolymer； Content determination

恩替卡韋為環(huán)戊基鳥嘌呤核苷類似物，是選擇性抗HBV的口服核苷類藥物[1-2]。恩替卡韋片劑（商品名：博路定）是由Bristol–Myers Squibb公司研發(fā)并于2005 年3月29日美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準上市[3]，2005年11月15日經(jīng)中國國家食品藥品監(jiān)督管理局批準在中國上市[4]。目前，臨床上應用的恩替卡韋治療慢性乙型肝炎（CHB）的劑型，主要有普通片劑、分散片以及膠囊劑。已有報道的新劑型包括軟膠囊劑[5]、液體制劑[6]、滴丸[7]、腸溶劑[8]及固體分散體[9]等?？谇凰偃苣┦菍⒁欢▌┝康挠行С煞秩苡诨蚍稚⒃诔赡げ牧现兄瞥傻闹苿10]，可在一分鐘內(nèi)于唾液中崩解，釋放出有效成分，經(jīng)口腔黏膜吸收，同時使藥物經(jīng)過吞咽后能在胃腸道內(nèi)快速溶出并吸收[11]?？谇凰偃苣┡c口腔崩解片、分散片等其它常規(guī)劑型相比，具有很多優(yōu)勢，如體積小，重量輕，便于攜帶運輸和貯存，工藝簡單，無水條件可服藥等[12-13]。經(jīng)多方文獻調(diào)查研究，目前國內(nèi)外文獻中對恩替卡韋口腔速溶膜劑的研究，尚未見相關(guān)文獻報道。本研究以聚乙烯醇/聚乙二醇接枝共聚物（Kollicoat？誖 IR）為成膜材料[14-15]，溶劑澆注法[16]制備新型恩替卡韋口腔速溶膜劑，并采用反相高效液相色譜對其進行分析方法建立和含量測定[17-18]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（島津LC-2010A，日本），電子天平（型號：CP214，奧豪斯儀器上海有限公司），超聲波清洗器（型號：KQ-300DE，昆山市超聲波儀器有限公司），水浴鍋（型號：88-1，常州國華電器有限公司），離心機（型號：H-1650，長沙湘儀離心機儀器有限公司），恒溫振蕩器（型號：SHZ-82，金壇市富華儀器有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（型號：DHG-9140A，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

恩替卡韋（批號：20150803，Eurapharm Inc.）；乙腈（批號：OCPA1H，色譜純，Honeywell），聚乙烯醇/聚乙二醇（3∶1）接枝共聚物（Kollicoat？誖 IR，批號：757287240， BASF），甘油（批號：20150202，浙江遂昌惠康藥業(yè)有限公司），海藻酸鈉（批號：F20060424，國藥集團化學試劑有限公司），二氧化鈦（批號：1208101，北京鳳禮精求商貿(mào)有限責任公司），甘露醇（批號：20150806，上海東土化工進出口有限公司），微晶纖維素-羧甲基纖維素鈉混合物（CeolusTM RC-A591NF，批號：B444，旭化成株式會社），其它試劑均為分析純。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 膜劑的制備

取300 mg Kollicoat？誖 IR加入10 mL的蒸餾水中，放置于80℃水浴中充分攪拌溶解，待Kollicoat？誖 IR完全溶解后在超聲儀上去除氣泡，再分別依次加入5 mg恩替卡韋、45 mg甘油、60 mg海藻酸鈉、5 mg二氧化鈦、5 mg RC-A591NF等使其溶解在溶液中，磁力攪拌至溶液混合均勻，使其在超聲儀上脫去氣泡，將最后得到的漿液均勻涂布于2 cm×15 cm的不銹鋼板上，置于60℃的電熱恒溫鼓風干燥箱內(nèi)干燥大約2.5 h。靜置放冷后從不銹鋼板上慢慢剝離得到膜劑，裁剪成2 cm×3 cm膜劑5片。

2.2 分析方法建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相A：乙腈-水（3∶97），流動相B：乙腈，檢測波長：254 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：25℃，進樣量：20 μL[15]。梯度洗脫程序見表1。

2.2.2 專屬性考察

使用乙腈-水（3∶97）混合溶劑，配制10 μg/mL的恩替卡韋對照品和供試品溶液。精密吸取20 μL，在上述色譜條件下注入高效液相色譜儀，考察恩替卡韋的HPLC分析方法專屬性。結(jié)果表明，恩替卡韋保留時間約為11.5 min，無雜質(zhì)峰對主藥峰形成干擾，專屬性強。見圖1。

2.2.3 線性關(guān)系

精密稱取恩替卡韋10 mg，置入10mL容量瓶加入適量用甲醇超聲溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。用流動相稀釋配制成藥物濃度分別為1.0、2.0、2.5、3.0、5.0、10.0 μg/mL的系列標準溶液。取標準溶液20 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以恩替卡韋濃度C（μg/mL）為橫坐標，峰面積A為縱坐標進行標準曲線的繪制，得到線性回歸方程：A=52548.1316C-639.5153，R2=0.9999。結(jié)果表明，在1.0～10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖2。

2.2.4 精密度

2.2.4.1 日內(nèi)精密度 精密移取標準品供試液適量于100 mL容量瓶，用流動相A（3%乙腈）定溶，配制成1、5、10 μg/mL的低、中、高三個濃度的溶液，在1 d內(nèi)不同時間點重復進樣5次，測定并計算其濃度，得日內(nèi)精密度。結(jié)果表明，低、中、高三個濃度相對標準偏差均小于2%，日內(nèi)精密度良好。見表2。

2.4.4.2 日間精密度 精密移取標準品供試液適量于100 mL容量瓶，用流動相A （3%乙腈）定溶，配制成1、5、10 μg/mL的低、中、高三個濃度的溶液，連續(xù)3天進樣3個濃度的供試品，測定并計算其濃度，得日間精密度。結(jié)果表明，低、中、高三個濃度相對標準偏差均小于2%，日內(nèi)精密度良好。見表3。

2.2.5 準確度

精密移取標準品供試液適量于100 mL容量瓶，用流動相A（3%乙腈）定溶，配制成1、5、10 μg/mL的低、中、高3個濃度的溶液各5份，再分別精密吸取各溶液20 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計算準確度。結(jié)果表明，低、中、高三個濃度條件下，準確度平均值為99.7%，準確度高。見表4。

2.2.6 定量限

精密移取1 μg/mL標準品供試液，稀釋至樣品溶液中主峰的響應值約為噪音水平的10倍。記錄色譜圖。當主峰的S/N=13.27時，得出本實驗恩替卡韋定量限為0.31 ng。

2.2.7 檢測限

精密移取1 μg/mL標準品供試液，稀釋至樣品溶液中主峰的響應值約為噪音水平的3倍。記錄色譜圖。當主峰的S/N=2.73時，得出本實驗恩替卡韋定量限為0.26 ng。

2.2.8 溶液穩(wěn)定性

精密稱取恩替卡韋標準品5.04 mg，于1000 mL容量瓶配制成標準溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8、10、12、24 h后按上述色譜條件進樣，計算RSD。結(jié)果見表5。結(jié)果表明，恩替卡韋溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 含量測定

裁取尺寸2 cm×3 cm的薄膜（n=3），置于100 mL的容量瓶，用適量流動相A（3%乙腈）溶解定溶。放置15分鐘，取3 mL溶液，12000 r/min離心10 min，再進行HPLC分析，計算出其含有的藥物含量為（98.93±0.55）%。

3 討論

雖然恩替卡韋常規(guī)制劑已上市，但在服用時通常需要飲水，這對在無水條件下或具有吞咽困難的患者用藥十分不便。為了提高藥物快速起效，同時提高患者的順應性，研究一種新型口腔速溶膜劑具有十分重要的科學意義。已有文獻報道表明，采用HPLC或HPLC-MS方法，可有效測定恩替卡韋原料藥和制劑的含量及有關(guān)物質(zhì)[17-23]。但是迄今為止，尚未見到恩替卡韋口腔速溶膜劑及含量測定相關(guān)文獻報道。

①本研究以Kollicoat？誖 IR為水溶性成膜材料，以甘油為增塑劑，海藻酸鈉為崩解劑，二氧化鈦為遮光劑，RC-A591NF為助懸劑，水為溶劑，采用溶劑澆注法成功制得恩替卡韋口腔速溶膜劑。

②本研究通過RP-HPLC分析方法學建立。所得恩替卡韋標準溶液線性回歸方程為：A=52548.1316C-639.5153，R2=0.9999，表明恩替卡韋在1.0～10.0 μg/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。低、中、高三種濃度的標準溶液，日內(nèi)精密度為0.15%～0.56%，日間精密度為0.35%～1.36%，準確度為99.70%，且供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，所測口腔速溶膜劑的藥物含量為（98.93±0.55）%，與理論值基本一致，符合質(zhì)量要求。本研究RP-HPLC方法專屬性強，精密度、準確度高，穩(wěn)定性好，可用于恩替卡韋口腔速溶膜劑的含量測定及質(zhì)量控制。

[參考文獻]

[1] 朱玫，姚光弼.恩替卡韋[J].肝臟，2003，8（2）：1-2.

[2] Levine S，Hernandez D，Yamanaka G，et al. Efficacies of ent？鄄icavir against lamivudine-resistant hepatitis B virus replication and recombinant polymerases in vitro [J]. Antimicrob Agents Chemother，2002，46（8）：2525-2532.

[3] Bernard EJ.US approves new HBV drug. IAPAC Mon，2005，11：110.

[4] 李霖，李玉珍.抗乙肝病毒新藥-恩替卡韋[J].新藥與臨床，2006，4（4）：56-58.

[5] 北京阜康仁生物制藥科技有限公司.恩替卡韋軟膠囊及其制備方法：中國，1732943A[P].2006-02-15.

[6] 布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司.低劑量液體恩替卡韋制劑和用途：中國，1658844A[P].2005-08-24.

[7] 北京阜康仁生物制藥科技有限公司.恩替卡韋滴丸及其制備方法：中國，1732945A[P].2006-02-15.

[8] 楊喜鴻.恩替卡韋的腸溶制劑及其制備方法：中國，1883459A[P].2006-12-27.

[9] 湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司.一種恩替卡韋固體分散體和一種恩替卡韋制劑：中國，106727339A[P].2017-05-31.

[10] 崔福德.藥劑學[M].2版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2011.

[11] Xu LL，Shi LL，Cao QR，et al. Formulation and in vitro char？鄄acterization of novel sildenafil citrate-loaded polyvinyl alcohol-polyethylene glycol graft copolymer-based orally dissolving films [J]. Int J Pharm，2014，473（1-2）：398-406.

[12] 黃勝炎.速溶膜劑[J].上海醫(yī)藥，2005，26（7）：305-306.

[13] 趙偉，康靜，王紅霞.口腔速溶膜劑及其應用[J].天津藥學，2013，25（4）：62-63

[14] 曹青日，施麗麗，徐衛(wèi)娟，等.一種口腔速溶膜劑及制備方法：中國，102824333[P].2014-05-14.

[15] 曹青日，施麗麗，崔京浩.西地那非口腔速溶膜劑及制備方法：中國，103989661[P].2014-08-20.

[16] 李德秋.世界口腔溶膜生產(chǎn)技術(shù)開發(fā)新進展[J].黑龍江醫(yī)藥，201l，24（3）：439

[17] 蔣銀妹，羅秀琴，徐燕，等.梯度洗脫反相高效液相色譜法測定恩替卡韋的有關(guān)物質(zhì)[J].藥物分析雜志，2009， 29（4）：676-679.

[18] 霍曉方，羅林，付超，等.HPLC法測定恩替卡韋原料藥含量及其有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥房，2008，19（16）：1254-1255.

[19] 陶玲，黃芳，宋偉峰，等.LC-MS法分析恩替卡韋口服制劑中的有關(guān)物質(zhì)[J].分析測試學報，2014，33（3）：362-366.

[20] 冀滿豐.高效液相色譜-梯度洗脫法測定恩替卡韋分散片的含量和有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥學，2012，21（9）：26-27.

[21] 劉緒林，張永玲.HPLC測定恩替卡韋原料藥含量及有關(guān)物質(zhì)[J].中國保健營養(yǎng)，2013（2）：293-294.

[22] 易毛，韓晉，吳素體，等.HPLC法測定恩替卡韋分散片中恩替卡韋的含量[J]. 解放軍藥學學報，2012，28（6）：520-522.

[23] 張蓮蓮.恩替卡韋膠囊的含量測定[J].海峽藥學，2007， 19（10）：78.

（收稿日期：2017-11-25 本文編輯：李岳澤）