魏騰 高瑩 曹青日

[摘要] 目的 建立恩替卡韋反相高效液相色譜（RP-HPLC）分析方法，測(cè)定口腔速溶膜劑中藥物含量。 方法 以聚乙烯醇/聚乙二醇接枝共聚物為成膜材料，溶劑澆注法制備恩替卡韋口腔速溶膜劑。采用Inertsil ODS-3 C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-水（3∶97）和乙腈為流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，檢測(cè)波長254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量20 μL，利用梯度洗脫程序測(cè)定恩替卡韋口腔速溶膜劑中藥物含量。 結(jié)果 恩替卡韋標(biāo)準(zhǔn)溶液線性回歸方程為：A=52548.1316C-639.5153 （R2=0.9999），日內(nèi)精密度為0.15%～0.56%，日間精密度為0.35%～1.36%，準(zhǔn)確度為99.70%，定量限為0.31 ng，檢測(cè)限為0.26 ng，且藥物溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。恩替卡韋口腔速溶膜劑中藥物含量為（98.93±0.55）%。 結(jié)論 本研究RP-HPLC分析方法專屬性強(qiáng)，精密度、準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好，適用于恩替卡韋口腔速溶膜劑中藥物含量測(cè)定。

[關(guān)鍵詞] 反相高效液相色譜；恩替卡韋；口腔速溶膜劑；聚乙烯醇/聚乙二醇接枝共聚物；含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）02（c）-0019-05

Determination of drug content in entecavir-loaded orodispersible film by a reverse phase high performace liqiud chromatography

WEI Teng1 GAO Ying2 CAO Qingri1

1.College of Pharmaceutical Sciences， Soochow University， Jiangsu Province， Suzhou 215123， China； 2.MSD R&D; （China） Co.， LTD.， Beijing 100000， China

[Abstract] Objective To establish a reverse phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC） method for the determination of drug content in entecavir-loaded orodispersible films （ODFs）. Methods The entecavir-loaded ODFs were prepared by using a solvent casting method with polyvinyl alcohol/polyethylene glycol graft copolymer as a film-forming agent. The RP-HPLC analysis was performed on an Inertsil ODS-3 C18 （4.6 mm×150 mm， 5 μm） column with mobile phases composed of acetonitrile-water （3∶97） and acetonitrile. The flow rate of mobile phase was 1.0 mL/min. The wavelength of UV detector was set at 254 nm and the injection volume was 20 μL. The column temparature was mantained at 25℃. The drug content of entecavir-loaded ODFs was analyzed by a gradient elution mode. Results The linear regression equation of entecavir standard solution was A=52548.1316C-639.5153 （R2=0.9999）. The intra-day precision was 0.15%-0.56%， the inter-day precision was 0.35%-1.36%， and the accuracy was 99.70%. The limit of detection was 0.31 ng and the limit of quantitation was 0.28 ng. The drug solution was stable within 24 h. The drug content of entecavir-loaded ODFs was （98.93±0.55）%. Conclusion The RP-HPLC method of entecavir shows high specificity， good precision， accuracy， and stability. This method is suitable for the detemination of drug content in entecavir-loaded ODFs.

[Key words] RP-HPLC； Entecavir； Orodispersible films； Polyvinyl alcohol/polyethylene glycol graft copolymer； Content determination

恩替卡韋為環(huán)戊基鳥嘌呤核苷類似物，是選擇性抗HBV的口服核苷類藥物[1-2]。恩替卡韋片劑（商品名：博路定）是由Bristol–Myers Squibb公司研發(fā)并于2005 年3月29日美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市[3]，2005年11月15日經(jīng)中國國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)在中國上市[4]。目前，臨床上應(yīng)用的恩替卡韋治療慢性乙型肝炎（CHB）的劑型，主要有普通片劑、分散片以及膠囊劑。已有報(bào)道的新劑型包括軟膠囊劑[5]、液體制劑[6]、滴丸[7]、腸溶劑[8]及固體分散體[9]等?？谇凰偃苣┦菍⒁欢▌┝康挠行С煞秩苡诨蚍稚⒃诔赡げ牧现兄瞥傻闹苿10]，可在一分鐘內(nèi)于唾液中崩解，釋放出有效成分，經(jīng)口腔黏膜吸收，同時(shí)使藥物經(jīng)過吞咽后能在胃腸道內(nèi)快速溶出并吸收[11]。口腔速溶膜劑與口腔崩解片、分散片等其它常規(guī)劑型相比，具有很多優(yōu)勢(shì)，如體積小，重量輕，便于攜帶運(yùn)輸和貯存，工藝簡單，無水條件可服藥等[12-13]。經(jīng)多方文獻(xiàn)調(diào)查研究，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)中對(duì)恩替卡韋口腔速溶膜劑的研究，尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以聚乙烯醇/聚乙二醇接枝共聚物（Kollicoat？誖 IR）為成膜材料[14-15]，溶劑澆注法[16]制備新型恩替卡韋口腔速溶膜劑，并采用反相高效液相色譜對(duì)其進(jìn)行分析方法建立和含量測(cè)定[17-18]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（島津LC-2010A，日本），電子天平（型號(hào)：CP214，奧豪斯儀器上海有限公司），超聲波清洗器（型號(hào)：KQ-300DE，昆山市超聲波儀器有限公司），水浴鍋（型號(hào)：88-1，常州國華電器有限公司），離心機(jī)（型號(hào)：H-1650，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），恒溫振蕩器（型號(hào)：SHZ-82，金壇市富華儀器有限公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)：DHG-9140A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

恩替卡韋（批號(hào)：20150803，Eurapharm Inc.）；乙腈（批號(hào)：OCPA1H，色譜純，Honeywell），聚乙烯醇/聚乙二醇（3∶1）接枝共聚物（Kollicoat？誖 IR，批號(hào)：757287240， BASF），甘油（批號(hào)：20150202，浙江遂昌惠康藥業(yè)有限公司），海藻酸鈉（批號(hào)：F20060424，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），二氧化鈦（批號(hào)：1208101，北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司），甘露醇（批號(hào)：20150806，上海東土化工進(jìn)出口有限公司），微晶纖維素-羧甲基纖維素鈉混合物（CeolusTM RC-A591NF，批號(hào)：B444，旭化成株式會(huì)社），其它試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 膜劑的制備

取300 mg Kollicoat？誖 IR加入10 mL的蒸餾水中，放置于80℃水浴中充分?jǐn)嚢枞芙?，待Kollicoat？誖 IR完全溶解后在超聲儀上去除氣泡，再分別依次加入5 mg恩替卡韋、45 mg甘油、60 mg海藻酸鈉、5 mg二氧化鈦、5 mg RC-A591NF等使其溶解在溶液中，磁力攪拌至溶液混合均勻，使其在超聲儀上脫去氣泡，將最后得到的漿液均勻涂布于2 cm×15 cm的不銹鋼板上，置于60℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥大約2.5 h。靜置放冷后從不銹鋼板上慢慢剝離得到膜劑，裁剪成2 cm×3 cm膜劑5片。

2.2 分析方法建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相A：乙腈-水（3∶97），流動(dòng)相B：乙腈，檢測(cè)波長：254 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：20 μL[15]。梯度洗脫程序見表1。

2.2.2 專屬性考察

使用乙腈-水（3∶97）混合溶劑，配制10 μg/mL的恩替卡韋對(duì)照品和供試品溶液。精密吸取20 μL，在上述色譜條件下注入高效液相色譜儀，考察恩替卡韋的HPLC分析方法專屬性。結(jié)果表明，恩替卡韋保留時(shí)間約為11.5 min，無雜質(zhì)峰對(duì)主藥峰形成干擾，專屬性強(qiáng)。見圖1。

2.2.3 線性關(guān)系

精密稱取恩替卡韋10 mg，置入10mL容量瓶加入適量用甲醇超聲溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。用流動(dòng)相稀釋配制成藥物濃度分別為1.0、2.0、2.5、3.0、5.0、10.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以恩替卡韋濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，得到線性回歸方程：A=52548.1316C-639.5153，R2=0.9999。結(jié)果表明，在1.0～10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖2。

2.2.4 精密度

2.2.4.1 日內(nèi)精密度 精密移取標(biāo)準(zhǔn)品供試液適量于100 mL容量瓶，用流動(dòng)相A（3%乙腈）定溶，配制成1、5、10 μg/mL的低、中、高三個(gè)濃度的溶液，在1 d內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定并計(jì)算其濃度，得日內(nèi)精密度。結(jié)果表明，低、中、高三個(gè)濃度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，日內(nèi)精密度良好。見表2。

2.4.4.2 日間精密度 精密移取標(biāo)準(zhǔn)品供試液適量于100 mL容量瓶，用流動(dòng)相A （3%乙腈）定溶，配制成1、5、10 μg/mL的低、中、高三個(gè)濃度的溶液，連續(xù)3天進(jìn)樣3個(gè)濃度的供試品，測(cè)定并計(jì)算其濃度，得日間精密度。結(jié)果表明，低、中、高三個(gè)濃度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，日內(nèi)精密度良好。見表3。

2.2.5 準(zhǔn)確度

精密移取標(biāo)準(zhǔn)品供試液適量于100 mL容量瓶，用流動(dòng)相A（3%乙腈）定溶，配制成1、5、10 μg/mL的低、中、高3個(gè)濃度的溶液各5份，再分別精密吸取各溶液20 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，低、中、高三個(gè)濃度條件下，準(zhǔn)確度平均值為99.7%，準(zhǔn)確度高。見表4。

2.2.6 定量限

精密移取1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品供試液，稀釋至樣品溶液中主峰的響應(yīng)值約為噪音水平的10倍。記錄色譜圖。當(dāng)主峰的S/N=13.27時(shí)，得出本實(shí)驗(yàn)恩替卡韋定量限為0.31 ng。

2.2.7 檢測(cè)限

精密移取1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品供試液，稀釋至樣品溶液中主峰的響應(yīng)值約為噪音水平的3倍。記錄色譜圖。當(dāng)主峰的S/N=2.73時(shí)，得出本實(shí)驗(yàn)恩替卡韋定量限為0.26 ng。

2.2.8 溶液穩(wěn)定性

精密稱取恩替卡韋標(biāo)準(zhǔn)品5.04 mg，于1000 mL容量瓶配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8、10、12、24 h后按上述色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算RSD。結(jié)果見表5。結(jié)果表明，恩替卡韋溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 含量測(cè)定

裁取尺寸2 cm×3 cm的薄膜（n=3），置于100 mL的容量瓶，用適量流動(dòng)相A（3%乙腈）溶解定溶。放置15分鐘，取3 mL溶液，12000 r/min離心10 min，再進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算出其含有的藥物含量為（98.93±0.55）%。

3 討論

雖然恩替卡韋常規(guī)制劑已上市，但在服用時(shí)通常需要飲水，這對(duì)在無水條件下或具有吞咽困難的患者用藥十分不便。為了提高藥物快速起效，同時(shí)提高患者的順應(yīng)性，研究一種新型口腔速溶膜劑具有十分重要的科學(xué)意義。已有文獻(xiàn)報(bào)道表明，采用HPLC或HPLC-MS方法，可有效測(cè)定恩替卡韋原料藥和制劑的含量及有關(guān)物質(zhì)[17-23]。但是迄今為止，尚未見到恩替卡韋口腔速溶膜劑及含量測(cè)定相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

①本研究以Kollicoat？誖 IR為水溶性成膜材料，以甘油為增塑劑，海藻酸鈉為崩解劑，二氧化鈦為遮光劑，RC-A591NF為助懸劑，水為溶劑，采用溶劑澆注法成功制得恩替卡韋口腔速溶膜劑。

②本研究通過RP-HPLC分析方法學(xué)建立。所得恩替卡韋標(biāo)準(zhǔn)溶液線性回歸方程為：A=52548.1316C-639.5153，R2=0.9999，表明恩替卡韋在1.0～10.0 μg/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。低、中、高三種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，日內(nèi)精密度為0.15%～0.56%，日間精密度為0.35%～1.36%，準(zhǔn)確度為99.70%，且供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，所測(cè)口腔速溶膜劑的藥物含量為（98.93±0.55）%，與理論值基本一致，符合質(zhì)量要求。本研究RP-HPLC方法專屬性強(qiáng)，精密度、準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好，可用于恩替卡韋口腔速溶膜劑的含量測(cè)定及質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2017-11-25 本文編輯：李岳澤）