馬文慧，周宣宣，彭禛菲，程曉通，張文佳，許倩，2，*

（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

烏鱧（Channa argus）俗稱黑魚，其作為藥用具有祛風(fēng)治疳、補(bǔ)脾益氣、滋補(bǔ)調(diào)養(yǎng)、生肌補(bǔ)血，促進(jìn)傷口愈合等功效[1]。魚類和其他海產(chǎn)品是高度易腐食品，由于其高水分活度，中性pH值、結(jié)締組織含量低、自溶酶的存在導(dǎo)致其不良?xì)馕逗涂诟械难杆僮兓痆2]，目前，國內(nèi)外對烏鱧的研究主要是針對養(yǎng)殖技術(shù)[3]、鑒定方法[4-6]、營養(yǎng)成分[7-10]和相關(guān)酶功能[11]等方面的研究。對于貯藏烏鱧魚片的研究僅見闕婷婷[12]利用不同低溫保鮮方法對烏鱧魚肉理化性質(zhì)以及組織結(jié)構(gòu)方面的研究，無凍藏及其營養(yǎng)價(jià)值相關(guān)研究。目前全球范圍內(nèi)采用的低溫冷鏈貯運(yùn)一般選擇0℃～4℃的冷藏保鮮，0℃～-2℃的冰溫保鮮，-2℃～-4℃的微凍保鮮以及-18℃～-40℃的凍藏保鮮這個(gè)溫度帶范圍[13]。由于采取低溫冷鏈長距離運(yùn)輸，成本高，覆蓋面窄，貯藏期短，運(yùn)輸工具有限，導(dǎo)致冷藏保鮮不能廣泛推廣。因此，本試驗(yàn)以烏鱧魚片為原料，采用冷凍貯藏方式，在烏鱧魚片貯藏期間以理化指標(biāo)評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)、脂肪及新鮮度的變化情況，了解長期凍藏烏鱧魚片品質(zhì)變化的內(nèi)在原因及機(jī)制，并通過比較得出長期凍藏時(shí)間內(nèi)的較好的冷凍保鮮方法，為烏鱧長期冷凍貯藏保鮮提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

烏鱧魚由阿拉爾農(nóng)貿(mào)市場提供，其平均體重為（1 923.04±173.67）g，平均體長為（42.13±1.93）cm，活體運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷（高純試劑）：北京賽因坦科技有限公司；硫酸銅、乙二胺四乙酸、鉬酸銨：天津市北辰方正試劑廠；酒石酸鉀鈉、尿素、氯化鈣、鹽酸、六水氯化鎂、抗壞血酸：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉：滄州津盛化工產(chǎn)品有限公司；氯化鈉、硫酸：北京化工廠；馬來酸、2-硝基苯甲酸、腺嘌呤核苷三磷酸：上海山普化工有限公司，以上均為分析純。

TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BSA2202S-CW電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；TGL-20K高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；TGL-20KR高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；F6/10手持式高速勻漿機(jī)：上海拓赫機(jī)電科技有限公司；PHS-3C PH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1　樣品處理

烏鱧魚活體運(yùn)至試驗(yàn)室后重?fù)糁滤馈⑷[、去內(nèi)臟，以垂直脊柱方向橫切切片，厚度約為2 cm，低溫流水清洗干凈，裝于聚乙烯保鮮袋內(nèi)置于冰箱，分別進(jìn)行-18℃和-40℃貯藏20周，每兩周從兩組中隨機(jī)選取3片，（20±2）℃流水解凍至溫度達(dá)到0℃以上后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測定，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次。

1.2.2　解凍損失的測定

參照王航[14]測定解凍損失的方法。烏鱧魚解凍前稱重為W1，（20±2）℃流水解凍后，將保鮮袋中的解凍流失的汁液倒掉，肉樣用吸水紙吸干，再次稱重W2，解凍汁液流失率按照下式計(jì)算：

式中：TL為解凍汁液流失率，%；W1為解凍前質(zhì)量，g；W2為解凍后質(zhì)量，g。

1.2.3　雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量

參照王航[14]的方法。

1.2.4　鹽溶性蛋白含量的測定

參照Pan等[15]建立的方法并稍作修改，取1 g魚肉，加入0.05 mol/L NaCl-20mg/mol Tris-馬來酸溶液15 mL 勻漿后，10 000 r/min離心 20 min，靜置 0.5 h，離心2次取沉淀，再加入15 mL冰冷的0.6 mol/L NaCl-20mg/mol Tris-馬來酸溶液，勻漿10 s，4℃提取1.5 h。然后4℃下，10 000 r/min離心30 min，取上清液攪拌均勻，計(jì)算鹽溶性蛋白含量（mg/g）。

1.2.5　鹽溶性蛋白Ca2+-ATPase活性

參照孔春麗[16]的試驗(yàn)方法并稍作修改，取5 mL蛋白溶液加熱至中心溫度為80℃，取出放入冰水中冷卻，用于Ca2+-ATPase活性及巰基含量的測定。Ca2+-ATPase活性的表示方法為1mg酶蛋白1 min內(nèi)生成的無機(jī)磷酸量，鹽溶性蛋白Ca2+-ATPase活性按照下式計(jì)算：

式中：APi為無機(jī)磷酸量，μmoL。

1.2.6　總巰基含量的測定

參照Kobayashi等[17]的方法并稍作修改，取0.5 mL 4mg/mL的鹽溶性蛋白溶液加到4.5 mL pH6.8，0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液中。取4 mL混合液，加入0.5mL0.2mol/L Tris-HCl，pH 8.0溶液，于 40℃下溫育 25 min，412 nm下測定其吸光度。空白組用0.6 mol/L KCl，pH 7.0代替。

式中：A為吸光值；B為待測蛋白濃度，mg/mL；C為分子吸光系數(shù)，其值為13 600 L/（mol·cm）；D為稀釋倍數(shù)。

1.2.7　水溶蛋白含量測定

依據(jù)Tadpitchayangkoon等[18]的方法稍作改動(dòng)，攪碎的魚肉與冰冷蒸餾水以1∶5（g/mL）的比例混合，勻漿2 min。勻漿后的溶液在4℃的冰箱中提取30 min，再在4℃下11 410 r/min離心20 min，取上清液攪拌均勻，計(jì)算水溶蛋白含量（mg/g）。

1.2.8　水溶蛋白濁度的測定

參照Wang等[19]的方法。蛋白溶液用pH 7.0，0.6 M NaCl-20 mM Tris-馬來酸緩沖液調(diào)至濃度為2.0mg/mL，于350 nm下測定吸光值。

1.2.9　水溶性蛋白巰基含量的測定

取0.5 mL 4mg/mL的水溶性蛋白溶液加入到4.0 mL pH 8.0的0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液中，測定方法同1.2.6。

1.2.10　過氧化值的測定

參照于夕娟等[20]所采用的分光光度法測定。稱取200mg油脂用氯仿-甲醇溶解（7+3），加入0.05 mL二氯化鐵溶液，搖勻，加入0.05 mL 30%硫氰酸鉀溶液，搖勻后放置5 min，以氯仿-甲醇混合溶劑為參比，于500 nm處測定吸光度。

1.2.11　共軛二烯值

參照Kim等[21]的方法。稱取200mg油脂樣品溶于97%正己烷，于233 nm下測定吸光值。

1.3　數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)利用SAS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用鄧肯氏多變域檢驗(yàn)法確定數(shù)據(jù)間的差異，P＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著，獲得各項(xiàng)數(shù)據(jù)間的差異顯著性情況，從而分析出兩種溫度對烏鱧魚片品質(zhì)的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1　解凍損失率變化

解凍損失是肉質(zhì)評(píng)定的重要指標(biāo)之一，解析損失分析見圖1。

圖1　解凍損失的分析Fig.1　Analysis for thawing loss

如圖1，其中0周代表烏鱧魚片在最新鮮時(shí)的初始狀態(tài)，隨著貯藏時(shí)間的不斷延長，2組魚片的解凍損失率在第20周的凍藏過程中先升高后下降。這可能是由于在慢速冷凍過程中形成的晶核少，冰晶大；冷凍前期冰晶刺破細(xì)胞膜使汁液流失，損失增加，解凍損失增大；隨貯藏時(shí)間延長，冰晶升華，肉的汁液含量相對減少，損失也相對減少。由于第6周解凍損失率開始降低并趨向平穩(wěn)；貯藏至16周，-40℃組解凍損失率為7.0%，且高于-18℃組的5.4%。-18℃和-40℃組在貯藏末期的解凍損失率分別達(dá)到了6.3%和7.5%，-40℃組解凍損失較高可能由于該溫度條件下冰的升華現(xiàn)象較-18℃更顯著，水分損失較多。

2.2　蛋白質(zhì)含量變化

圖2　蛋白質(zhì)含量的分析Fig.2 Analysis for protein content

烏鱧魚蛋白質(zhì)含量分析見圖2。如圖2，隨著冷凍貯藏時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)變性變成肽段或者多肽，兩組蛋白質(zhì)含量均顯著下降（P＜0.05）。新鮮烏鱧魚片蛋白質(zhì)含量為47.2%。烏鱧魚片蛋白含量在0～4周差異顯著，而-40℃組相對-18℃組下降速率較快。-18℃蛋白質(zhì)含量從4周至8周下降顯著（P＜0.05），后趨于平緩，至貯藏第14周，蛋白含量急速下降，后趨于平緩。在貯藏末期，-18℃組和-40℃組蛋白質(zhì)含量為24.7%和29.4%，且-40℃組蛋白含量高于-18℃組含量。因此對于短期儲(chǔ)存，-40℃組相對于-18℃組而言損失相對較少，這主要是由于肌球蛋白重鏈減少引起的[22]。凍藏溫度越低，溶解性下降得越快，凍藏時(shí)間越長，肌肉蛋白的溶解性越差。

2.3　鹽溶性蛋白的測定

鹽溶性蛋白是魚肌中的主要蛋白質(zhì)，占總蛋白的65%～75%[23]，烏鱧魚鹽溶性蛋白含量分析見圖3。

圖3　鹽溶性蛋白含量分析Fig.3　Analysis for salt-soluble protein

如圖3所示，2組魚片的鹽溶性蛋白含量在0～20周的凍藏期內(nèi)都顯著下降（P＜0.05），新鮮烏鱧魚片的鹽溶性蛋白含量為28.59%，第10周時(shí)-18℃組的含量只有13.27%，-40℃組的含量只有13.57%，10周到20周依舊呈下降趨勢，但較前10周平緩，-18℃組最終的鹽溶性蛋白含量為2.83%，-40℃組的含量為4.83%。-40℃的鹽溶性蛋白含量高于-18℃組。這與孔春麗[16]在不同溫度下凍藏鯉魚片的品質(zhì)研究的實(shí)驗(yàn)變化趨勢相符。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，凍藏溫度越低，烏鱧魚片變性程度越輕，抑制變性效果越好。在凍藏過程中，由于部分結(jié)合水形成冰晶，肌動(dòng)球蛋白相互之間生成氫鍵、疏水鍵、二硫鍵和鹽鍵，從而形成不溶性聚集體，導(dǎo)致鹽溶性降低。

2.4　Ca2+-ATPase活性的測定

ATP降解是在死后的魚和貝類中最重要的生物化學(xué)變化之一[24]，烏鱧魚肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性分析見圖4。

圖4　肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性分析Fig.4　Analysis for Ca2+-ATPase enzyme activity

如圖4所示，在整個(gè)凍藏期內(nèi)，兩組魚片的Ca2+-ATPase活性含量均呈下降趨勢，且兩組樣品的Ca2+-ATPase活力在前6周均顯著下降（P＜0.05）。在0～8周貯藏過程中，-40℃組的Ca2+-ATPase活性高于-18℃組，此時(shí)-18℃組及-40℃組的Ca2+-ATPase活性分別為 2.98 、3.07 μmol·min/mg。8 周后兩組 Ca2+-ATPase含量無顯著差異（P＞0.05）并趨于平緩。在研究中，0～2周的存放過程中觀察到急劇下降現(xiàn)象的結(jié)果與Mehta等[23]一致。解凍損失，巰基含量等變化與Ca2+-ATPase活性的降低相一致，原因可能在凍藏過程中，肌動(dòng)球蛋白的頭部結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，嚴(yán)重時(shí)會(huì)形成二硫鍵，進(jìn)而導(dǎo)致其酶活性的下降或喪失[25]。結(jié)果表明在整個(gè)貯藏過程中，-40℃條件下的蛋白質(zhì)在前期得到了較好的保護(hù)。

2.5　總巰基的測定

總巰基含量反應(yīng)了蛋白質(zhì)變性聚合的程度[25]，烏鱧魚巰基含量分析見圖5。如圖5，在凍藏過程中，隨著時(shí)間的延長，兩組樣品的巰基含量均逐漸降低，-18℃組在前2周的下降速度顯著（P＜0.05），可能是前兩周的蛋白質(zhì)交聯(lián)程度較大，巰基被氧化程度較嚴(yán)重，從第2周之后下降速度趨于平緩；-40℃組在整個(gè)凍藏期間下降程度不顯著（P＞0.05），這與陰曉菲[26]的試驗(yàn)結(jié)果有些差異，這可能與材料的處理方式和魚類的品種不同有關(guān)；在0～20周凍藏過程中，-40℃組一直比-18℃組的巰基含量高，表明在較低溫度凍藏條件下，可以有效的抑制巰基的氧化、二硫鍵的互換或蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用。以上結(jié)果表明較低的凍藏條件下的蛋白質(zhì)交聯(lián)程度和蛋白的變性程度較低，巰基的氧化程度較輕微，魚肉的品質(zhì)維持的較好。

圖5　巰基含量的分析Fig.5　Analysis for sulfhydryl content

2.6　肌漿蛋白質(zhì)含量變化

烏鱧魚肌漿蛋白分析見圖6。

圖6　肌漿蛋白的分析Fig.6　Analysis for sarcoplasmic protein

如圖6所示，兩組肌漿蛋白含量都顯著下降（P＜0.05），第0周肌漿蛋白質(zhì)含量為21.59%，兩組肌漿蛋白含量都在2周～4周大幅度下降，在第4周時(shí)-18℃和-40℃的肌漿蛋白含量分別為17.1%和15.7%。兩組含量在6至10周下降無顯著差異（P＞0.05）。第20周時(shí)，-18℃和-40℃的肌漿蛋白含量較新鮮值下降了10.6%和5.7%。從圖6可以看出，隨著貯藏期的延長，肌原纖維蛋白與肌漿蛋白變化不一致，相對其肌原纖維蛋白含量變化波動(dòng)較大，其原因有待研究。結(jié)果表明，溫度越低烏鱧魚片質(zhì)量保存的越好。

2.7　水溶性蛋白濁度變化

烏鱧魚肌漿濁度變化分析見圖7。

圖7　肌漿濁度變化分析Fig.7　Analysis for turbidity changes

如圖7所示，隨著時(shí)間的延長，兩組水溶性蛋白的濁度都呈現(xiàn)顯著的增加（P＜0.05）。-40℃組蛋白質(zhì)在6周前沉淀不顯著（P＞0.05），在第8周有顯著提高（P＜0.05），并在第12周達(dá)到最大值。-18℃組平穩(wěn)上升至第12周達(dá)到最高值，之后有所下降。在6周～20周，-40℃的濁度高于-18℃，與烏鱧魚片的水溶性蛋白含量降低的變化規(guī)律一致，因此濁度的變化可能與水溶性蛋白含量相關(guān)，可能由于蛋白質(zhì)交聯(lián)引起蛋白質(zhì)聚集，疏水殘基暴露，導(dǎo)致蛋白的變性、沉淀。結(jié)果說明-18℃對于烏鱧魚片的蛋白保存具有更好的保護(hù)作用。

2.8　水溶性巰基含量變化

水溶性蛋白巰基含量變化如圖8所示。

圖8　肌漿巰基含量分析Fig.8　Analysis for sulfhydryl content

隨著凍藏時(shí)間的延長，兩組樣品中的總巰基含量均顯著降低（P＜0.05），在貯藏過程中-18℃組和-40℃組巰基含量初值分別為3.8 mol/105g和4.0 mol/105g，貯藏至第10周時(shí)烏鱧魚片巰基含量降至2.9 mol/105g和3.5mol/105g，此時(shí)兩組存在顯著差異（P＜0.05）。12周后巰基含量先升高，后趨于平緩，至貯藏末期20周時(shí)，兩組分別降至2.7 mol/105g和2.6 mol/105g。結(jié)果表明0～20周貯藏中，-40℃組下降速率較平緩，8周～14周貯藏中-40℃組含有較高的巰基含量，說明較好的延遲蛋白質(zhì)的氧化。

2.9　過氧化值（peroxide value，POV）變化

烏鱧魚過氧化值的分析見圖9。

圖9　過氧化值的分析Fig.9　Analysis for peroxide value changes

如圖9，在整個(gè)貯藏過程中，2組魚片的POV總體呈上升趨勢，其中出現(xiàn)三次上升三次下降趨勢。-40℃組的過氧化值在整個(gè)貯藏過程中都明顯低于-18℃組。貯藏至第6周，-18℃組和-40℃組分別下降至0.54 mmol/kg和0.23 mmol/kg，后上升。貯藏至第13周，-18℃組及-40℃組POV分別降低至0.43 mmol/kg、0.63mmol/kg，后再上升。在貯藏20周時(shí)-18℃組較新鮮值顯著升高了0.30 mmol/kg，-40℃升高了0.02 mmol/kg（P＜0.05）。這種變化規(guī)律與Zaghbib等[27]的結(jié)論相一致。呂飛等[28]在研究竹筴魚在凍藏過程中也得出相類似的結(jié)論，其POV值總體呈上升趨勢，但烏鱧魚片在凍藏過程中的POV值有下降趨勢，這可能是由于魚的種類、脂肪含量、生長環(huán)境的差異所致。結(jié)果說明較低的凍藏溫度對脂肪氧化的抑制效果更好，更有利于烏鱧魚片的保藏。

2.10　共軛二烯值的變化

烏鱧魚共軛二烯值的分析見圖10。

圖10　共軛二烯值的分析Fig.10　Analysis for Conjugated diene value

如圖10，在0～6周凍藏期，兩組樣品的共軛二烯值都呈先上升后下降的趨勢，-18℃組和-40℃組分別在第2、10、18 和 2、10、16 周成為共軛二烯值的下降變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，轉(zhuǎn)折點(diǎn)后呈現(xiàn)下降趨勢。0～8周共軛二烯值大小為：-18℃處理組＞-40℃處理組，且-18℃組和-40℃組魚片在第2周和第10周達(dá)到最大值3.6 mmoL/kg和3.2 mmoL/kg。共軛二烯通過多不飽和脂肪酸雙鍵的轉(zhuǎn)移形成中間體[29]，是反映脂肪氧化的初級(jí)產(chǎn)物。關(guān)于不同凍藏溫度對烏鱧魚片的共軛二烯的產(chǎn)生無顯著影響的原因有待進(jìn)一步研究。

3　結(jié)論

在-18℃和-40℃下貯藏的兩組烏鱧魚片中蛋白質(zhì)含量都隨時(shí)間的延長而減少，脂肪含量也因?yàn)檠趸纸舛鴮?dǎo)致下降，與-18℃組相比，-40℃組在20周的儲(chǔ)存過程中能顯著延緩烏鱧魚片在貯藏過程中蛋白質(zhì)分解、巰基的暴露氧化、過氧化值的升高、共軛二烯值的增長，一定程度上可以降低烏鱧魚品質(zhì)的下降速率，延長貨架期，但-40℃組和-18℃組的解凍損失速率無顯著差異。試驗(yàn)表明，不同的凍藏溫度可以造成烏鱧魚肉品質(zhì)的不同變化，凍藏保鮮雖然可以延長魚體的保鮮期限，但魚肉部分凍結(jié)，冰晶增長破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致營養(yǎng)價(jià)值以及風(fēng)味下降，影響魚的品質(zhì)。因此，冷藏及微凍條件下烏鱧魚的品質(zhì)變化規(guī)律還有待進(jìn)一步的研究。

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