張 露,樊 威,蘇 建,焦曉磊,周 劍,黃志鵬,趙 瀚,趙仲孟,段元亮,李 強,杜 軍,卓 婷,蘇全森,吳 俊,羅 煜

(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，成都 611731； 2. 四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 內(nèi)江 641199)

【研究意義】烏鱧(Channaargus)是鱧科魚類中分布最廣、產(chǎn)量最大的種類[1]，廣泛分布于長江流域以及北至黑龍江一帶，而白化烏鱧主要分布在嘉陵江中下游流域。烏鱧身上花紋黑白相間，生性兇猛，繁殖力極強，白化烏鱧體形和生活習(xí)性等與普通烏鱧相同，但白化烏鱧體色呈較單一的白色或灰白色[2]；烏鱧和白化烏鱧都具有生長速度快、適應(yīng)性強、肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、少刺等特點，且白化烏鱧還具有一定的藥用價值，深受消費者喜愛[3]。隨著烏鱧和白化烏鱧市場需求量的不斷增大，其養(yǎng)殖規(guī)模不斷增大，但部分烏鱧和白化烏鱧養(yǎng)殖群體仍存在個體表型差異較大、遺傳背景不清楚等問題，對烏鱧和白化烏鱧遺傳多樣性的研究可以為其種質(zhì)資源保護(hù)和選育提供科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】烏鱧和白化烏鱧曾被認(rèn)為是2個不同的物種，后來有研究通過對兩者的形態(tài)特征、乳酸脫氫酶、酯酶同工酶、染色體類型和線粒體等進(jìn)行了多方面的比較，認(rèn)為白化烏鱧不能被劃分為單獨的亞種，應(yīng)視為普通烏鱧的白化變種[4]。目前對白化烏鱧的研究主要集中在繁育技術(shù)[5]、養(yǎng)殖管理[3, 6]、染色體核型[7]、疾病防治[8-9]和營養(yǎng)成分[2, 10]等方面，對于現(xiàn)有白化烏鱧資源的遺傳多樣性的研究相對較少。微衛(wèi)星標(biāo)記具有中性、共顯性和高度多態(tài)等特點，是非常適合用于群體遺傳研究的分子標(biāo)記[11]。微衛(wèi)星標(biāo)記作為種群遺傳分析最有效的分子標(biāo)記之一，被廣泛運用于以飄魚、黃顙魚、花鱸等為代表的魚類群體遺傳多樣性研究[12-14]。近年來，已有許多烏鱧微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)及利用的研究報道，其中Gul等[15]從烏鱧基因組文庫中分離出了10個二堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點；King等利用磁珠捕獲技術(shù)從烏鱧中獲得了19個四堿基重復(fù)的微衛(wèi)星位點[16]；溫曉曦等[17]利用磁珠富集法結(jié)合放射性同位素雜交方法分離烏鱧的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，并報道了19個多態(tài)性微衛(wèi)星位點，包括3個二堿基重復(fù)和16個三堿基重復(fù)的微衛(wèi)星位點；隨后Yan等[18]通過FIASCO法構(gòu)建烏鱧微衛(wèi)星文庫，篩選到了18個多態(tài)性微衛(wèi)星位點，包括1個二堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點和17個四堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點，這些標(biāo)記的開發(fā)為烏鱧遺傳多樣性的研究提供了基礎(chǔ)。微衛(wèi)星標(biāo)記已被應(yīng)用于烏鱧養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性研究，有研究分別采用10和14個烏鱧微衛(wèi)星標(biāo)記對我國不同地理位置的烏鱧養(yǎng)殖群體遺傳多樣性進(jìn)行了研究，并分析了現(xiàn)有烏鱧養(yǎng)殖群體間的遺傳距離，為烏鱧的選育提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[19-20]。然而目前對于利用微衛(wèi)星標(biāo)記對不同地區(qū)白化烏鱧群體的研究還鮮有報道?！颈狙芯壳腥朦c】為探明白化烏鱧與烏鱧養(yǎng)殖群體遺傳多樣性，本研究采用20個微衛(wèi)星標(biāo)記對不同地理位置的烏鱧和白化烏鱧群體微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性和遺傳分化特征進(jìn)行分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究擬為烏鱧和白化烏鱧群體的遺傳資源保護(hù)及綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與DNA提取

7個不同地理位置的4個烏鱧群體和3個白化烏鱧育成群體的樣本采集信息見表1。采集肌肉或鰭條組織樣本，用90%的酒精保存待用。采用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取樣本DNA，提取方法按照試劑盒說明書操作。提取的DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，放-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 烏鱧和白化烏鱧群體樣本采集信息Table 1 Sampling locations and information for Channa argus and Albino Channa argus populations populations

1.2 PCR擴增及產(chǎn)物檢測

采用前人開發(fā)的20對烏鱧微衛(wèi)星引物(表2)對所有群體進(jìn)行PCR擴增[16, 18]。PCR反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL 2×TaqPCR Mix(生工生物工程(上海)股份有限公司)、1 μL模版DNA、上下游引物各1 μL、9.5 μL ddH2O。PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，進(jìn)行35個循環(huán)擴增(95 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸5 min，最后12 ℃保存。STR基因分型和引物合成均委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表2 用于本研究的微衛(wèi)星引物相關(guān)信息Table 2 Primers used in the present study

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用CERVUS 3.03[21]進(jìn)行哈迪溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)檢驗，并計算等位基因數(shù)(Na)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)。利用Arlequin 3.5[22]進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)和遺傳分化指數(shù)(F-statistics，F(xiàn)ST)分析，并使用MEGA 5.0[23]軟件基于Nei’s遺傳距離構(gòu)建UPMGA系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點多態(tài)性

如表3所示，所有20對微衛(wèi)星引物共檢測出356個等位基因，Na介于4～40，每個位點平均有17.8個等位基因。Ho介于0.000～0.791，平均值為0.578；He介于0.310～0.910，平均值為0.732；PIC值介于0.271～0.901，平均值為0.700，其中16個位點均具有高度多態(tài)性(PIC>0.5)，位點CarA118、CarC104、CarC116和CA04多態(tài)性相對較低。哈迪溫伯格平衡檢驗(HWE)顯示位點CarA118和CarC104未顯著偏離哈迪溫伯格平衡，其他位點均顯著偏離哈迪溫伯格平衡。

表3 微衛(wèi)星位點遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters among 16 loci of Channa argus and Albino Channa argus populations

2.2 群體遺傳多樣性

對4個烏鱧和3個白化烏鱧群體的遺傳多樣性分析結(jié)果(表4)顯示，7個群體的Na為3.45～13.90，Ho為0.399～0.757，He為0.397～0.785，PIC值為0.344～0.753，其中HZ群體PIC值最高，且所有烏鱧群體的Na、Ho、He、PIC均高于白化烏鱧群體。

表4 烏鱧和白化烏鱧群體的遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of Channa argus and Albino Channa argus populations

2.3 群體的遺傳分化

7個群體的遺傳分化指數(shù)FST在0.07876～0.4030(表5)，所有群體間的遺傳分化均達(dá)顯著水平(P<0.05)。3個白化烏鱧群體間的FST值為0.08 785～0.12 342，4個烏鱧群體間的FST值為0.07 876～0.17 185，白化烏鱧和烏鱧群體間的FST

表5 不同群體間的遺傳分化指數(shù)(FST)Table 5 fixation indexes (FST) among Channa argus and Albino Channa argus populations

值為0.22 290～0.40 303，兩組不同烏鱧群體之間的FST值相對高于組內(nèi)群體間的FST值。

將4個烏鱧群體和3個白化烏鱧群體分為兩組進(jìn)行AMOVA分析(表6)，這幾個群體的遺傳變異主要來源于個體內(nèi)，占遺傳變異來源總量的69.65%，有19.95%的遺傳變異來自組間，9.64%來自于組內(nèi)群體間。

表6 烏鱧和白化烏鱧群體的分子方差分析Table 6 AMOVA analysis among the Channa argus and Albino Channa argus populations

通過UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果可以看出4個烏鱧群體和3個白化烏鱧群體分別被聚類到了2個獨立分支上(圖1)，4個烏鱧群體中WH和JR群體遺傳距離較近，而3個白化烏鱧群體中LS和NJ群體的遺傳距離相對更近。

圖1 烏鱧和白化烏鱧群體UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 UPGMA phylogenetic tree of Channa argus and Albino Channa argus populations

3 討 論

遺傳多樣性與物種的生存力、適應(yīng)力和進(jìn)化潛力密切相關(guān)，是評估種群資源狀況的重要依據(jù)，等位基因數(shù)、雜合度、多態(tài)信息含量等遺傳參數(shù)是反應(yīng)群體遺傳多樣性的主要參數(shù)[24]。本研究所有的356個等位基因，Ho介于0.000～0.791，平均值為0.578；He介于0.310～0.910，平均值為0.732，相對與Zhu等[19]對4個不同地區(qū)烏鱧群體的微衛(wèi)星標(biāo)記的研究中其Ho和He值分別為0.70～0.84和0.69～0.83，通過與前人對烏鱧的研究比較顯示，本研究中的群體Ho和He處于相對較低水平，有研究指出當(dāng)群體雜合度在0.5～0.8即可認(rèn)為具有較高的多樣性[24]，本研究的烏鱧群體雜合度均值均高于0.5，總體看來遺傳多樣性較豐富。此外，本研究中的20個微衛(wèi)星標(biāo)記PIC值介于0.271～0.901，根據(jù)Botstein等[25]的標(biāo)準(zhǔn)PIC≥0.5為高度多態(tài)性，本研究中有16個位點具有高度多態(tài)性(PIC> 0.5)，這些微衛(wèi)星位點為烏鱧和白化烏鱧提供了豐富的遺傳信息，可用于烏鱧和白化烏鱧遺傳多樣性的評估。

通過對4個烏鱧和3個白化烏鱧群體的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)所有在所有群體中WH和HZ群體的Na均大于13個，而DH和JR群體的Na均大于6個，而3個白化烏鱧RC、NJ、LS群體的Na均小于4個，烏鱧群體的Na均高于白化烏鱧，且所有烏鱧群體的Ho和He均高于白化烏鱧群體。通過對兩種烏鱧的PIC值估算發(fā)現(xiàn)白化烏鱧的PIC值為0.344～0.414，處于中度多態(tài)水平，而烏鱧的PIC值為0.513～0.753，處于高度多態(tài)水平，可見白化烏鱧群體的遺傳多樣性要低于烏鱧群體，在繁育過程中應(yīng)加強白化烏鱧遺傳多樣性保護(hù)，盡量避免近親交配。

遺傳分化指數(shù)FST是用來衡量群體間遺傳分化程度的重要參數(shù)，7個群體的FST在0.07 876～0.40 303，且所有群體間的遺傳分化均達(dá)顯著水平(P<0.05)，表明群體間均存在一定的遺傳分化。烏鱧群體和白化烏鱧群體間遺傳分化較大，白化烏鱧和烏鱧群體間的FST值為0.22 290～0.40 303，其中白化烏鱧LS群體和烏鱧DH群體間遺傳分化最大(FST=0.40 303)。3個白化烏鱧群體間的FST值為0.08 785～0.12 342，4個烏鱧群體間的FST值為0.07 876～0.17 185，2組烏鱧群體在組內(nèi)群體間遺傳分化相對較小。將4個烏鱧群體和3個白化烏鱧群體分為2組進(jìn)行AMOVA分析可以發(fā)現(xiàn)這幾個群體的遺傳變異主要來源于個體內(nèi)和組間，組內(nèi)群體間變異來源較少。而UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果顯示4個烏鱧群體和3個白化烏鱧群體分別被聚類到了2個獨立分支上，表明烏鱧和白化烏鱧間群體間有較明顯的遺傳差異，已有研究推斷白化烏鱧是烏鱧白化變異形成的群體[4, 7, 26]，而根據(jù)本研究結(jié)果可以推斷白化烏鱧經(jīng)過長期的人工定向選育，已經(jīng)開始逐步分化為1個與烏鱧存在較大遺傳差異的獨立群體。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究結(jié)果表明3個白化烏鱧群體的遺傳多樣性均相對低于4個烏鱧，在繁育過程中應(yīng)加強白化烏鱧遺傳多樣性保護(hù)，盡量避免近親交配，本研究為烏鱧和白化烏鱧的遺傳資源保護(hù)及綜合利用提供理論依據(jù)。