劉鑫陽，宋忠云，楊 晨，和秋菊，易傳輝，朱恩驕

(1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院，昆明 650224；2.云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224; 3.西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院，昆明 650224；4.云南林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，昆明 650224)

【研究意義】胡蜂通常稱為黃蜂或馬蜂，為膜翅目(Hymenoptera)胡蜂科(Vespidae)昆蟲的總稱，主要包括胡蜂亞科(Vespinae)、馬蜂亞科(Polistiinae)、蜾蠃亞科(Eumeninae)等6個(gè)亞科，全世界已記錄5445種(亞種)，其中中國(guó)記錄290種(亞種)，胡蜂屬昆蟲17種[1-4]。金環(huán)胡蜂(VespamandariniaSmith, 1852)屬膜翅目(Hymenoptera)胡蜂科(Vespidae)胡蜂屬(Vespa)中性情兇猛、體型最大的捕食性肉食昆蟲，俗稱“虎頭蜂”[5]，具有極高的食用、藥用、生態(tài)和保健價(jià)值[6-7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，由于市場(chǎng)對(duì)胡蜂蛹的需求急劇增加，促進(jìn)了金環(huán)胡蜂人工養(yǎng)殖的快速興起，目前已遍布南方各地。但由于技術(shù)不成熟，許多關(guān)鍵養(yǎng)殖技術(shù)有待突破，僅能實(shí)現(xiàn)交配、人工越冬和初巢階段的人工養(yǎng)殖；同時(shí)，目前人工養(yǎng)殖存在其它嚴(yán)重問題，如對(duì)蜜蜂的危害，特別是對(duì)養(yǎng)殖蜜蜂的危害極其嚴(yán)重，部分地方造成胡蜂養(yǎng)殖農(nóng)戶和蜜蜂養(yǎng)殖農(nóng)戶的嚴(yán)重對(duì)立和沖突[8]。目前對(duì)金環(huán)胡蜂的研究主要集中在生物學(xué)特性等方面[9-10]，部分研究涉及危害防控等方面[11]，少數(shù)研究涉及遺傳多樣性與線粒體全基因組研究[12-13]。【本研究切入點(diǎn)】到目前為此，未見利用mtDNACOⅠ基因?qū)θ斯ゐB(yǎng)殖金環(huán)胡蜂遺傳多樣性相關(guān)研究。線粒體基因具有高度保守性、原始系遺傳、進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，被廣泛用于昆蟲分類、系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳、物種起源和分化等領(lǐng)域研究[14]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究選用線粒體COⅠ基因標(biāo)記，對(duì)云南主要人工養(yǎng)殖區(qū)金環(huán)胡蜂遺傳多樣性進(jìn)行研究，以期弄清養(yǎng)殖種群遺傳多樣性狀況，為該昆蟲科學(xué)養(yǎng)殖和對(duì)蜜蜂與其它生物多樣性的危害管理提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 COⅠ序列試驗(yàn)樣品

供試金環(huán)胡蜂共237頭，收集時(shí)間為2017年11月至2019年10月，收集地為云南省人工養(yǎng)殖最主要的8個(gè)地級(jí)市(表1)。將收集到的金環(huán)胡蜂浸泡在45 mL無水乙醇離心管中，記錄采集的地理位置和時(shí)間，置于-20 ℃冰箱中備用。

表1 金環(huán)胡蜂樣品采集信息Table 1 Sample collection information of Vespa mandarinia

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 取金環(huán)胡蜂胸部肌肉10 mg，選用Magen公司的HiPureInsectDNAKit試劑盒，并參考其說明書步驟提取DNA。試驗(yàn)后將DNA儲(chǔ)存于2～8 ℃冰箱中備用；若時(shí)間較長(zhǎng)，則儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增與測(cè)序 鑒定用COⅠ基因上游引物L(fēng)1490為5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，下游引物H2198為5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′[15]。PCR反應(yīng)體系為30 μL，其中DNA模板3 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，LATaqPreMix15 μL，ddH2O10 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在GmbH Power Cycler SL 96型PCR擴(kuò)增儀上完成，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性40 s，45 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增結(jié)果通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送擎科生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 首先使用Bioedit對(duì)獲得所有原始序列進(jìn)行比對(duì)分析[16]，計(jì)算堿基組成；再利用DNAsp 5.0軟件分析序列多態(tài)性[17]，序列單倍型多樣性、核苷酸多樣性等。用Arlequin 3.5軟件進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)，并計(jì)算群體間的分化水平(Fst)[18]。用DNAsp 5.0軟件分析序列單倍型，并導(dǎo)出單倍型序列，利用Popart 1.7軟件繪制單倍型中介網(wǎng)絡(luò)圖[19]；利用MEGA軟件構(gòu)建單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹，并對(duì)其起源和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列堿基組成及變異

截取比對(duì)后的600 bp編碼區(qū)序列進(jìn)行分析。在金環(huán)胡蜂線粒體COⅠ基因中A、G、T、C 4種堿基的平均含量為29.62%，12.81%，38.44%，19.13%，A+T的含量為68.05%，C+G的含量為31.95%，A+T堿基含量(68.06%)明顯高于C+G含量(31.94%)，說明COⅠ基因具有A+T堿基偏向性。序列變異分析結(jié)果顯示共有保守位點(diǎn)563個(gè)，變異位點(diǎn)37個(gè)，占分析位點(diǎn)總數(shù)的6.16%。變異類型主要為堿基轉(zhuǎn)換和堿基顛換，未發(fā)現(xiàn)堿基插入和缺失。在這37個(gè)變異位點(diǎn)中，有30個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)，7個(gè)顛換位點(diǎn)。

2.2 群體多樣性

由表2可知，單倍型分析共發(fā)現(xiàn)12個(gè)單倍型，其中，Hap_1、Hap_2、Hap_4、Hap_6、Hap_7、Hap_8為共有單倍型，其余6個(gè)為群體獨(dú)有單倍型。其中單倍型Hap_7出現(xiàn)次數(shù)最多，為主體單倍型。從養(yǎng)殖地區(qū)來看，楚雄地區(qū)單倍型較為豐富，有7種單倍型；其次為保山地區(qū)，有4種單倍型；昆明地區(qū)有3種，普洱、紅河地區(qū)有2種，曲靖、德宏和文山均僅有1種單倍型。

表2 線粒體DNA COⅠ序列單倍型分布情況Table 2 Haplotype distribution of COⅠ sequence in mitochondrial DNA

由表3可知，整體單倍型多樣性(Hd)為0.82958。各地理群體單倍型多樣性在0～0.74100，不同地理群體差異較大，其中，以楚雄最高(0.74100)，其次為保山(0.67308)；文山、德宏和曲靖最低(均為0)。整體核苷酸平均差異數(shù)(K)為15.18387，整體核苷酸多樣性(Pi)為0.02526。核苷酸平均差異數(shù)和核苷酸多樣性均以曲靖、德宏和文山最小(均為0)；平均核苷酸差異數(shù)以楚雄的最大(16.21254)，其次為昆明(16.04505)，核苷酸多樣性以昆明最大(0.02670)，其次為楚雄(0.02698)。

表3 云南省金環(huán)胡蜂樣本采集信息與多樣性指數(shù)Table 3 Sample information and diversity index of Vespa mandariniain Yunnan

由表4可知，本研究中使用核苷酸差異(Dxy)和核苷酸凈遺傳距離(Da)來表示群體之間的核苷酸多態(tài)性。各養(yǎng)殖地區(qū)核苷酸分歧度(Dxy)在0.00009～0.05191，其中，曲靖和德宏間最大(0.05191)，保山和曲靖間最小(0.00009)；核苷酸凈遺傳距離(Da)在-0.00024～0.05164，其中普洱和昆明間最小(-0.00024)，德宏和曲靖間最大(0.05164)。

表4 線粒體DNA核苷酸分歧度(Dxy)和凈遺傳距離(Da)Table 4 Mitochondrial DNA nucleotide divergence (Dxy) and net genetic distance (Da)

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳分化

由表5可知，各養(yǎng)殖種群金環(huán)胡蜂種群內(nèi)遺傳距離在0.00～0.0283。其中，楚雄種群內(nèi)遺傳距離最大(0.0283)；其次為昆明(0.0279)和保山(0.0263)，文山、曲靖和德宏3個(gè)地區(qū)種群最小(均為0)。

表5 種群內(nèi)平均遺傳距離Table 5 Average genetic distance within the group

由表6可知，各養(yǎng)殖種群間遺傳距離在0.0001～0.0544，其中以德宏與普洱地區(qū)種群的遺傳距離最大(0.0544)，其次為德宏與文山種群(0.0054)，曲靖和紅河種群的遺傳距離最小(0.0001)，這說明遺傳距離與地理距離沒有關(guān)系。

表6 種群間平均遺傳距離Table 6 Average genetic distance between groups

由表7可知，分子方差分析(AMOVA)結(jié)果顯示，50.48%的變異來源種群間，種群內(nèi)部變異為49.52%，說明遺傳變異來源于種群外部，但與種群內(nèi)部遺傳變異比例相近，差異較小；基因分化系數(shù)Fst=0.50482，差異較顯著(P<0.001)，表明種群間分化強(qiáng)烈，但不同地區(qū)養(yǎng)殖種群間存在一定交流。

表7 線粒體DNA COⅠ序列分子方差分析Table 7 Amova of mitochondrial DNA COⅠ sequence

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹與單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖

由圖1可知，利用鄰接法(NJ)對(duì)12個(gè)單倍型進(jìn)行聚類分析，形成了2個(gè)較為明顯的分支。其中單倍型Hap_1，Hap_2，Hap_3，Hap_4，Hap_5與Hap_6形成一個(gè)分支，說明它們間的親緣關(guān)系較近，可能來源于同一原始種群。其余單倍型形成另一個(gè)分支，表明它們可能來源于另一原始種群。

圖1 鄰接法(NJ)構(gòu)建的COⅠ基因單倍型的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.1 Phylogenetic tree of COⅠ gene haplotype constructed by neighborhood-joining method

由圖2可知，網(wǎng)絡(luò)中介圖顯示，單倍型有較明顯的分化，形成2個(gè)主要聚類簇。其中單倍型Hap_1、Hap_2、Hap_3、Hap_4、Hap_5與Hap_6為一個(gè)聚類簇，單倍型Hap_7、Hap_8、Hap_9、Hap_10、Hap_11、Hap_12為一個(gè)聚類簇，單倍型Hap_2和Hap_7出現(xiàn)的頻率最高，包含的地區(qū)最豐富。多數(shù)單倍型之間只有1個(gè)突變位點(diǎn)。

3 討 論

3.1 遺傳多樣性

研究結(jié)果顯示，金環(huán)胡蜂mtDNACOⅠ基因A+T的含量為68.05%，表明mtDNACOⅠ基因具有明顯的AT堿基偏向性，與典型的昆蟲線粒體堿基組成特點(diǎn)相符[20]；共發(fā)現(xiàn)12個(gè)單倍型，其中6個(gè)為共享單倍型，6個(gè)為各群體獨(dú)有，表明各養(yǎng)殖種群為適應(yīng)環(huán)境發(fā)生了變異，或與當(dāng)?shù)匾吧N群進(jìn)行了基因交流；單倍型Hap_7出現(xiàn)次數(shù)最多，該單倍型為養(yǎng)殖種群中適應(yīng)性較強(qiáng)并廣泛分布的原始單倍型，可能來源于同一原始種群。大多數(shù)群體中都出現(xiàn)了共享單倍型，這些單倍型在金環(huán)胡蜂進(jìn)化過程中相對(duì)穩(wěn)定，更適合當(dāng)前環(huán)境。群體內(nèi)的線粒體單倍型多樣性較為豐富，說明該群體具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，在云南復(fù)雜多變的生境中具有較大的生存空間。單倍型多樣性和核苷酸多樣性常被作為評(píng)價(jià)物種遺傳多樣性的重要指標(biāo)，兩者相對(duì)應(yīng)的單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)的值越大，物種遺傳多樣性越高[21]。金環(huán)胡蜂養(yǎng)殖種群整體單倍型多樣性(Hd)較高，為0.82958，但核苷酸多樣性(Pi)較低，僅為0.02526，表明不同地區(qū)養(yǎng)殖種群可能來源于少數(shù)相同原始種群，經(jīng)歷了近似于自然種群“瓶頸效應(yīng)”之后短時(shí)期內(nèi)的快速擴(kuò)張，核苷酸變異積累不足[22]。

每個(gè)圓圈代表一種單倍型，其大小與該單倍型出現(xiàn)的頻率成正比Each circle represents a haplotype, and its size is directly proportional to the frequency of the haplotype圖2 金環(huán)胡蜂編碼區(qū)單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖(COⅠ)Fig.2 Haplotype network intermediary diagram of the coding area of Vespa mandarinia(COⅠ)

3.2 群體的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳分化

各地區(qū)金環(huán)胡蜂養(yǎng)殖種群組內(nèi)遺傳距離在0～0.0283，基因分化系數(shù)大(Fst=0.50482)，表明不同種群間強(qiáng)烈分化，可能受德宏種群影響，該原始種群主要來源于緬甸?；蚍只禂?shù)的值介于0～0.05表示種群間遺傳分化程度很弱，0.05～0.15為分化中等，0.15～0.25為分化程度較大，大于0.25為分化程度很大[23]。分子方差分析顯示，50.48%的變異來源種群間，種群內(nèi)部變異為49.52%，表明遺傳變異主要來源于種群外部，但與內(nèi)部變異相近，說明各種群間存在一定基因交流，同時(shí)與當(dāng)?shù)匾吧N群或外地引入種群基因交流強(qiáng)烈。研究結(jié)果表明，云南不同地區(qū)養(yǎng)殖的金環(huán)胡蜂原始種源來源較復(fù)雜，可能來源于少數(shù)幾個(gè)原始種群，在養(yǎng)殖過程中與當(dāng)?shù)匾吧N群和外來種群(主要是緬甸種群)進(jìn)行了基因交流，造成了養(yǎng)殖胡蜂單倍型多樣性高，核苷酸多樣性低，遺傳結(jié)構(gòu)與分化復(fù)雜化格局。這與云南金環(huán)胡蜂養(yǎng)殖情況一致。筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南人工養(yǎng)殖金環(huán)胡蜂第一代原始種源多數(shù)來源于保山龍陵，在養(yǎng)殖過程中部分地區(qū)采用了當(dāng)?shù)胤N源，或與當(dāng)?shù)胤N源進(jìn)行了雜交，并引入了外地種源(主要是緬甸種源)。

4 結(jié) 論

云南金環(huán)胡蜂養(yǎng)殖種群?jiǎn)伪缎投鄻有暂^高，但核苷酸多樣性較低；各種群間的分化系數(shù)Fst強(qiáng)烈，遺傳變異主要來源于種群外部，但與種群內(nèi)部變異相近。表明原始種群來源于少數(shù)母種群，在養(yǎng)殖過程中原始種群后代經(jīng)歷了與本地和外地(主要是緬甸)種群的雜交，種群經(jīng)歷了快速擴(kuò)張過程。研究結(jié)果對(duì)指導(dǎo)胡蜂人工養(yǎng)殖和危害防控具有一定意義。