黃 婷，陳福艷，張 彬，黎 銘，林 勇，李莉萍，童桂香，唐瞻楊，韋信賢，蔣偉添

(1.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學研究院/廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，南寧 530021；2.廣西北海市海城區(qū)海洋局，廣西 北海 536000)

【研究意義】雙棘黃姑魚(Protonibeadiacanthus) 隸屬于鱸形目石首魚科原黃姑魚屬，是近海暖溫性底層魚類，主要分布在朝鮮、日本、東南亞國家及我國沿海海域，因其生長較快、抗病力強、肉味鮮美、經(jīng)濟效益高，近年來已發(fā)展成為我國南方沿海新興的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種[1]。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，雙棘黃姑魚在養(yǎng)殖過程中病害時有發(fā)生。目前，關(guān)于雙棘黃姑魚的研究主要集中在人工育苗技術(shù)[2]、養(yǎng)殖技術(shù)[3]、攝食[4]及人工繁育[5-7]等方面，對其發(fā)生病害的病原了解較少。因此，分離鑒定雙棘黃姑魚源致病性病原菌，對查明引起雙棘黃姑魚出現(xiàn)大批量死亡的病因和及科學指導其防控的規(guī)范用藥具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)是弧菌科(Vibrionaceae)的成員，該屬包括29個有效物種[8-10]，屬于革蘭氏染色陰性和兼性好氧細菌，主要從沿海、公海和深海環(huán)境分離獲得[11]。發(fā)光桿菌屬的幾個物種對低溫動物包括魚類[12-14]和軟體動物[15-16]均表現(xiàn)出致病性。目前，關(guān)于托魯尼發(fā)光桿菌(P.toruni)的研究較少，僅見Labella等[17]報道從患病的海鯛(Sparussarba)體內(nèi)分離到托魯尼發(fā)光桿菌，且能在春季和秋季感染海鯛發(fā)病，感染魚體大小為85.00～300.00 g。而與托魯尼發(fā)光桿菌同屬的美人魚發(fā)光桿菌(P.damselae)可感染多種養(yǎng)殖魚類，具有較高致病性，對海水養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟損失較嚴重，因此研究較多。Pedersen等[12]從患病虹鱒魚分離到美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種(P.damselaesubsp.damselae)，并證實其具有很強的溶血性，毒力最強的菌株半數(shù)致死量達3.9×103CFU(20 ℃)，可導致病魚出血而大批量死亡。邵蓬等[18]研究發(fā)現(xiàn)，美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種對半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)具有較強的致病性，可導致病魚肝臟和腸道發(fā)生出血性壞死而死亡，死亡率達25%。張飛等[19]從患病的大黃魚分離到美人魚發(fā)光桿菌，病魚體表無破損，但可見血絲，短期內(nèi)死亡率在20%以上，該美人魚發(fā)光桿菌的胞外產(chǎn)物含多種毒力因子，與該菌對大黃魚的致病性密切相關(guān)。王瑞旋等[20]從患病的卵形鯧鯵(Trachinotusovatus)脾臟分離到美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種，病魚體表完好，其脾臟和肝臟有灰白色結(jié)節(jié)。王庚申等[21]從患病條石鯛(Oplegnathusfasciatus)的內(nèi)臟分離到美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種(P.damselaesubsp.piscicida)，病魚體色加深，體表無明顯發(fā)病癥狀，內(nèi)臟可見1～2 mm大小的白色結(jié)節(jié)，病魚死亡率在20%以上?！颈狙芯壳腥朦c】2021年1月廣西北海市某養(yǎng)殖場網(wǎng)箱養(yǎng)殖的雙棘黃姑魚大批量死亡，養(yǎng)殖經(jīng)濟損失極大，亟需弄清病因及對癥施藥，但目前針對雙棘黃姑魚源致病菌的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分離鑒定發(fā)病雙棘黃姑魚的致病菌并進行藥敏試驗，以期為指導廣西沿海地區(qū)養(yǎng)殖戶防治雙棘黃姑魚托魯尼發(fā)光桿菌引發(fā)的病害提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年1—8月在廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室進行?；疾‰p棘黃姑魚樣品于2021年1月20日采自廣西北海市鐵山港養(yǎng)殖網(wǎng)箱，濕重為150.00～250.00 g[平均為(194.52±50.46)g]，健康雙棘黃姑魚采自廣西北海市某養(yǎng)殖場，濕重為(61.38±5.14)g，試驗前暫養(yǎng)7 d。

主要試劑及儀器設(shè)備：細菌分離用血瓊脂培養(yǎng)基(廣東江門市凱林貿(mào)易有限公司)、基因鑒定用16S rRNA序列擴增通用引物及PCR擴增所用試劑[寶生物工程(大連)有限公司]、藥敏紙片(杭州天和生物制劑公司)。

1.2 剖檢與病原菌分離

在無菌條件下，剖解患病雙棘黃姑魚，取肝臟、脾臟和腎臟組織分別接種于血瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取優(yōu)勢單菌落繼續(xù)分離純化，獲得的菌株20210120，將純化獲得的菌株接種至胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)中，28 ℃下100 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，一部分用于人工感染試驗，一部分加20%甘油保種于-86 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人工感染試驗

人工感染試驗在500 L水族箱中進行，共設(shè)6組，每組20尾雙棘黃姑魚。將1.2中培養(yǎng)的菌液濃度用生理鹽水分別調(diào)整至2.5×108、2.5×107、2.5×106、2.5×105和2.5×104CFU/mL后進行腹腔注射(0.2 mL/尾，即菌懸液的注射劑量分別為5.0×107、5.0×106、5.0×105、5.0×104和5.0×103CFU/尾)，以每尾腹腔注射生理鹽水溶液0.2 mL為對照(CK)。每2 d換水50%，連續(xù)充氣，水溫保持在22～30 ℃，每天按試驗魚體重的3%分2次投料。每天觀察、統(tǒng)計雙棘黃姑魚發(fā)病情況，同時采用血瓊脂培養(yǎng)基對瀕臨死亡的雙棘黃姑魚腦、肝臟、脾臟和腎臟進行細菌分離。

采用Reed-Muench法測得的半數(shù)致死量(LD50)根據(jù)如下公式計算。

距離比例r=(高于50%死亡率-50%)/(高于50%-低于50%死亡率)

lgLD50=高于50%死亡率稀釋度倒數(shù)的對數(shù)+距離比例×稀釋倍數(shù)的對數(shù)

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態(tài)學觀察 分離菌株純化培養(yǎng)后，進行細菌革蘭氏染色，觀察其形態(tài)特征。

1.4.2 16S rDNA序列測定分析 細菌基因組DNA提?。悍蛛x菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，28 ℃下100 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取1.5 mL菌液，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，參考Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒(杭州博日科技有限公司)操作說明提取細菌基因組DNA。

16S rDNA序列擴增：參考Heuer等[22]的方法合成細菌16S rDNA序列擴增通用引物，引物序列見表1。參考康為世紀生物科技股份有限公司的2×EsTaqMaster Mix聚合酶PCR反應(yīng)試劑盒說明進行PCR擴增，擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳(電壓120 V，電泳30 min)對PCR擴增產(chǎn)物進行鑒定。

表1 特異性引物序列Table 1 The specific primers used for PCR analysis

PCR產(chǎn)物回收純化和測序：引物合成、PCR產(chǎn)物純化和測序均委托廣州擎科生物技術(shù)有限公司完成。將所得序列在GenBank中進行BLAST比對，利用Clustal X和MEGA 7.0進行序列同源分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.4.3 多位序列分析 多基因序列擴增：參照Labella等[17]的方法，選取gapA(甘油醛-3-磷酸脫氫酶A)、topA(DNA拓撲異構(gòu)酶I)、mreB(細胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)合物MreBCD)、ftsZ(GTP微管蛋白結(jié)合)和gyrB(細胞分裂蛋白)基因進行多位序列分析。參考1.4.2的方法進行PCR擴增(退火溫度均為55 ℃)。

PCR產(chǎn)物膠回收純化：參考天根生化科技(北京)有限公司的通用型DNA純化回收試劑盒說明進行PCR產(chǎn)物純化回收。

連接：參考TaKaRa克隆載體pMD19-T Vector試劑盒操作說明進行PCR產(chǎn)物克隆，反應(yīng)體系：Solution I 5.0 μL，pMD19-T Vector 1.0 μL，DNA模板4.0 μL。配置好后混勻，16 ℃過夜。

轉(zhuǎn)化：取出-80 ℃保存的DH5a感受態(tài)細胞，置冰上融化后加入于含連接的產(chǎn)物中，輕微旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴30 min；將離心管置于42 ℃熱激60～90 s后迅速冰浴2～3 min；向每個離心管中加入500.0 μL LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后置于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)45 min(150 r/min)；將離心管內(nèi)容物混勻，吸取100.0～400.0 μL加入含Amp+的LB培養(yǎng)基上均勻涂開。將LB培養(yǎng)基置于室溫下至液體全部被吸收，37 ℃下倒置培養(yǎng)過夜。

轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定：用無菌槍頭挑取LB培養(yǎng)基上3～5個單菌落，分別接種于3.5 mL LB液體培養(yǎng)基中(含100.0 g/mL Amp)，37 ℃下165 r/min振蕩培養(yǎng)10～12 h；以5.0 μL菌液為模板，進行PCR鑒定(反應(yīng)體系50.0 μL)，操作步驟同1.4.3中的多基因序列擴增。陽性菌液委托廣州擎科生物技術(shù)有限公司測序鑒定，余下菌液4 ℃保存?zhèn)溆?；測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對。使用MEGA 6.0中的Neighbour-joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap值設(shè)置為1000次。

1.5 藥物敏感性試驗

采用紙片擴散法，將培養(yǎng)24 h的細菌培養(yǎng)物用滅菌PBS洗下后，將菌液濃度稀釋至1.0×108CFU/mL，取0.2 mL菌懸液涂布于TSA培養(yǎng)基。選擇12種藥敏紙片(恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、頭孢氨芐、鏈霉素、慶大霉素、羅紅霉素、阿莫西林、頭孢拉啶、新生霉素和利福平)勻貼于培養(yǎng)基上，每種藥敏片設(shè)3個平行試驗，28 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑，根據(jù)說明書的標準確定分離菌株20210120對不同抗生素的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離

從圖1可看出，菌株20210120在血瓊脂培養(yǎng)基上生長較好(圖1-A)；28 ℃培養(yǎng)24 h后，菌株20210120的菌落直徑約2.0 mm，圓形，乳白色，中心隆起，表面光滑，邊緣整齊；革蘭氏染色呈陰性，菌體寬0.6～1.1 μm、長2.3～3.3 μm(圖1-B)。說明菌株20210120在血瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落較小。

圖1 菌株20210120的革蘭氏染色(1000×)Fig.1 Gram staining of 20210120 strain(1000×)

2.2 人工感染試驗

由表2可知，對健康雙棘黃姑魚腹腔注射菌株20210120的菌懸液后，各感染組雙棘黃姑魚陸續(xù)出現(xiàn)死亡。其中，5.0×107CFU/尾處理組試驗魚全部死亡(注射后3 d內(nèi)出現(xiàn)大量死亡，6 d內(nèi)全部死亡)；10 d后各處理組試驗魚均不再死亡；在整個試驗過程(14 d)中，對照組的試驗魚未發(fā)生死亡，5.0×106和5.0×105CFU/尾處理組試驗魚的死亡率分別為90.00%和75.00%，5.0×104和5.0×103CFU/尾處理組試驗魚的死亡率較低，分別為40.00%和10.00%。同時，從感染死亡的雙棘黃姑魚腎臟中均分離到相同病原菌?？梢?，分離到的菌株20210120能使健康雙棘黃姑魚致病，且毒性較強，經(jīng)Reed-Muench法測得感染14 d該菌對雙棘黃姑魚(61.38±5.14)g的半數(shù)致死量(LD50)為1.59×102CFU/g。人工感染癥狀與自然發(fā)病癥狀相似，表現(xiàn)為鰭條基部出血，眼渾濁，空腸、腸壁出血，腹水，膽汁稀少，肝臟腫大變白，離群慢游，并伴有每天數(shù)尾到數(shù)十尾死亡。

表2 菌株20210120的人工感染試驗(14 d)結(jié)果Table 2 Results of artificial infection of the 20210120 strain(14 d)

2.3 16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA雙向測序，將測得的16S rRNA序列與GenBank中的16S rRNA序列進行BLAST比對分析，結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，菌株20210120與已報道托魯尼發(fā)光桿菌(登錄號KX855661)的16S rRNA序列相似性最高(99.93%)；基于16S rRNA序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果(圖3)也顯示，菌株20210120與托魯尼發(fā)光桿菌聚成一簇。因此，初步鑒定菌株20210120屬于托魯尼發(fā)光桿菌。

圖2 菌株20210120的16S rRNA序列測序Fig.2 16S rRNA sequencing of strain 20210120

圖3 菌株20210120與其他同屬不同種發(fā)光桿菌16S rRNA序列的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of strain 20210120 and 16S rRNA sequences from other different species of Photobacterium

2.4 多基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建

選擇6個管家基因(16S rRNA、gyrB、gapA、topA、ftsZ和mreB)序列，使用MEGA 6.0對連接的16S rRNA序列(3700 bp)進行比對并進一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果(圖4)表明，菌株20210120與托魯尼發(fā)光桿菌形成一個獨立的簇，且與其他5個管家基因的相似性分別為99.50%(gyrB)、99.44%(mreB)、100.00%(topA)、99.86%(gapA)和99.83%(ftsZ)。因此，綜合文獻[17，23-24]的結(jié)論和圖4的分析結(jié)果，可確定菌株20210120為托魯尼發(fā)光桿菌。

圖4 6個基因(16S rRNA、gyrB、gapA、topA、ftsZ和mreB)序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.4 Neighbor joining phylogenetic tree based on six concatenated genes(16S rRNA，gyrB，gapA，topA，ftsZ and mreB) sequence similarity

2.5 菌株20210120的藥敏試驗

由表3可知，在對12種抗生素的敏感性試驗結(jié)果中，菌株20210120對喹諾酮類藥物(恩諾沙星、氧氟沙星和環(huán)丙沙星)、磺胺類藥物(復(fù)方新諾明)、β-內(nèi)酰胺酶類(頭孢氨芐)、氨基糖苷類抗生素(鏈霉素和慶大霉素)7種藥物敏感，對羅紅霉素、阿莫西林、頭孢拉啶和新生霉素4種藥物耐藥，對利福平中等敏感。說明恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、頭孢氨芐、慶大霉素和鏈霉素可作為防治雙棘黃姑魚托魯尼發(fā)光桿菌的備選藥物。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙》2020年 1號和2號文件，恩諾沙星是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準使用藥物目錄中的藥物，因此，建議選用恩諾沙星對雙棘黃姑魚托魯尼發(fā)光桿菌進行防治。

表3 菌株20210120的藥敏試驗結(jié)果Table 3 The results of the drugs sensitivity test on 20210120 strain

3 討 論

對病原細菌進行形態(tài)學觀察、生理生化分析和基因序列分析，可確保鑒定結(jié)果的可靠性[17-20]。本研究從廣西北海鐵山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖的患病雙棘黃姑魚腎臟分離到1株病原菌20210120，通過16S rRNA序列測序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果顯示分離菌株與GenBank中的托魯尼發(fā)光桿菌聚為一簇，16S rRNA序列相似性達99.93%；由于目前缺乏病原菌20210120的標準菌株，因此未能進行生理生化指標驗證，但參考Labella等[17]的方法利用6個管家基因(16S rRNA、gyrB、gapA、topA、ftsZ和mreB)進行多位點序列分析驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株20210120與托魯尼發(fā)光桿菌形成一個獨立分支，證實其為托魯尼發(fā)光桿菌；雙棘黃姑魚的發(fā)病季節(jié)為冬季低溫季節(jié)，感染魚體的體重為150.00～250.00 g，與Labella等[17]報道感染托魯尼發(fā)光桿菌海鯛的體重相近，但發(fā)病季節(jié)不同，推測托魯尼發(fā)光桿菌能導致150.00～250.00 g規(guī)格的海水魚發(fā)病，而發(fā)病季節(jié)存在差異是由魚種不同或地理位置不同引起。

發(fā)光桿菌屬隸屬于弧菌科，其中有些發(fā)光桿菌對魚類致病性較強，如美人魚發(fā)光桿菌可感染多種魚類，且具有高致病性[12，18-20]。感染發(fā)光桿菌后，患病魚類表現(xiàn)的癥狀存在明顯差異。王瑞旋等[20]報道2006年從海南省陵水患病的卵形鯧鯵分離出美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種，病魚體表完好，脾臟和腎臟出現(xiàn)灰白色結(jié)節(jié)；邵蓬等[18]報道2018年天津市感染美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種的半滑舌鰨大量死亡，腹腔嚴重腫脹，腹部兩側(cè)肌肉出血，腸道和肝臟也有大量出血。本研究中，感染托魯尼發(fā)光桿菌雙棘黃姑魚的癥狀有出血和腹部脹大，與邵蓬等[18]報道的半滑舌鰨感病癥狀相似，推測托魯尼發(fā)光桿菌也像美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種一樣感染海水魚并致死。本研究發(fā)現(xiàn)的養(yǎng)殖雙棘黃姑魚感染托魯尼發(fā)光桿菌尚屬首次報道，該菌的病原在癥狀上與以往報道的黃姑魚創(chuàng)傷弧菌病[25]、哈維氏弧菌病[26]、溶藻弧菌病[27]相似，均出現(xiàn)鰭條出血、肝臟脹大和空腸癥狀。但目前對于托魯尼發(fā)光桿菌的致病機制及危害程度的了解甚少，有待后續(xù)深入探究。

托魯尼發(fā)光桿菌分離后需及時開展病原菌藥敏試驗，以便指導養(yǎng)殖戶科學用藥。已有研究表明，恩諾沙星對革蘭氏陰性菌有很強的殺滅作用，可控制致病菌引起的危害[28-29]。本研究藥敏試驗結(jié)果表明，菌株20210120對喹諾酮類藥物(恩諾沙星、氧氟沙星和環(huán)丙沙星)、磺胺類藥物(復(fù)方新諾明)、β-內(nèi)酰胺酶類(頭孢氨芐)和氨基糖苷類抗生素(鏈霉素和慶大霉素)等表現(xiàn)敏感。結(jié)合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙》文件中批準使用的藥物目錄，建議選用恩諾沙星對雙棘黃姑魚托魯尼發(fā)光桿菌進行防治。

4 結(jié) 論

托魯尼發(fā)光桿菌是引起廣西北海雙棘黃姑魚發(fā)病死亡的病原菌，對喹諾酮類藥物(恩諾沙星、氧氟沙星和環(huán)丙沙星)、磺胺類藥物(復(fù)方新諾明)、β-內(nèi)酰胺酶類(頭孢氨芐)和氨基糖苷類抗生素(鏈霉素和慶大霉素)等表現(xiàn)敏感，實際生產(chǎn)中可考慮將該7種藥物作為防治雙棘黃姑魚托魯尼發(fā)光桿菌引起相關(guān)疾病的藥物使用，尤其推薦使用恩諾沙星。