袁宇，藍(lán)艷禹，黃臣，李媚，廖安平

（廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實驗室培育基地，廣西高校化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過程新技術(shù)重點(diǎn)實驗室，廣西南寧530006）

右旋糖酐是一種具有很高的生物相容性和生物水解性的、由簡單的葡萄糖單元聚合而成的中性細(xì)菌胞外多糖[1]，右旋糖酐的基本化學(xué)式是 H（C6H10O5）nOH，它是蔗糖在細(xì)菌胞外酶右旋糖酐蔗糖酶的作用下生成的一種α-葡聚糖[2]。右旋糖酐產(chǎn)品是一類親水性很強(qiáng)的高分子化合物，合成的方法主要有微生物法和酶法[3]，微生物法合成右旋糖酐的菌主要是嗜中溫或嗜熱細(xì)菌如明串珠菌、葡糖桿菌、鏈球菌、乳酸菌等[4-9]。右旋糖酐是第一個商業(yè)化的細(xì)菌胞外多糖[10]，由腸膜明串珠菌合成的水溶性右旋糖酐廣泛應(yīng)用于制藥、食品、農(nóng)業(yè)和精細(xì)化工等領(lǐng)域[11]，在低分子量藥物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，右旋糖酐的應(yīng)用可提高藥物的水溶性[12]。2015年4月，在WHO基本藥物清單中，右旋糖酐T70被列為血漿代用品的基本藥物[1]。右旋糖酐的合成受到一系列物理和化學(xué)因素的影響，如溶解度、黏度、比旋度以及培養(yǎng)液中的氮、磷離子等[13]。為使右旋糖酐的產(chǎn)量最大化，研究人員已經(jīng)對生物合成條件進(jìn)行了優(yōu)化[14]。據(jù)報道，右旋糖酐的分子量大小和產(chǎn)量取決于各種反應(yīng)過程變量如溫度、蔗糖和受體的濃度等[15]。本試驗采用腸膜明串珠菌（CICC-21725），在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對合成培養(yǎng)的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化以提高蔗糖的轉(zhuǎn)化率，為該菌的應(yīng)用提供可靠數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

腸膜明串珠菌CICC-21725：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

無水乙醇、蔗糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、瓊脂粉（均為生物試劑）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；乙腈（色譜純）：德國默克公司；水：自制二重蒸餾水。

1.2　儀器與設(shè)備

LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；LT-XT搖床：瑞士Kuhner AG；ACB-4A1垂直流超凈工作臺：新加坡藝思高科技有限公司；SZ-97自動三重二次蒸餾水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠；LC20AD RID-10A高效液相色譜儀：日本島津。

1.3　試驗方法

1.3.1　培養(yǎng)基的配制

種子培養(yǎng)基組份（g/L）：蔗糖130，蛋白胨2.0，磷酸氫二鈉1.4，磷酸二氫鉀0.3。

發(fā)酵培養(yǎng)基組份（g/L）：蔗糖 80，蛋白胨 7.0，磷酸氫二鈉1.4，磷酸二氫鉀0.3。

1.3.2　液相色譜條件

色譜柱：Polaris 5 NH2柱，4.6 mm×250 mm，5 μm，安捷倫公司；流動相：乙腈/水=78∶22（體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測器溫度：40℃；進(jìn)樣量：20L。

1.3.3　蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將蔗糖干燥至恒重后稱取0.5g（精確至萬分之一），用75%乙腈（體積比）定容至50 mL，蔗糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液的濃度為10mg/mL，稀釋配制一系列濃度的蔗糖溶液，用0.22 μm的有機(jī)系針式過濾頭過濾，放置備用。

1.3.4　轉(zhuǎn)化過程中蔗糖的質(zhì)量計算

從種子培養(yǎng)基中取10%（質(zhì)量比）的種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，以接種時刻為0點(diǎn)取樣，之后每3個小時取樣，用流動相稀釋定容后在液相色譜中對蔗糖濃度進(jìn)行分析，蔗糖質(zhì)量的計算按照式1計算：

式中：m為取樣時轉(zhuǎn)化液中蔗糖的質(zhì)量，g；m1為轉(zhuǎn)化液的質(zhì)量，g；c為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得到的被測組分的濃度，mg/mL；V為樣品溶液定容體積，mL；m0為所取得轉(zhuǎn)化液的質(zhì)量，g。

蔗糖轉(zhuǎn)化率按照式2計算：

式中：m初為接種時轉(zhuǎn)化液中蔗糖的質(zhì)量，g；m終為反應(yīng)12 h后轉(zhuǎn)化液中蔗糖的質(zhì)量，g；m′為取出樣品中蔗糖的質(zhì)量，g。

2　結(jié)果與分析

2.1　蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.3.3中的試驗方法，以峰面積/10 000為橫坐標(biāo)，蔗糖濃度為縱坐標(biāo)，用origin擬合出蔗糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

由圖1（a）可知：當(dāng)蔗糖濃度在0.04 g/L～2.0 g/L時，線性回歸方程為Y=0.051 02X+0.002 62，其中R2=0.999 94；由圖1（b）可知：當(dāng)蔗糖濃度在 0.8 g/L～10.0 g/L時，線性回歸方程為Y=0.049 08X+0.056 51，其中R2=0.999 94。

圖1　蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of sucrose

2.2　轉(zhuǎn)化過程中蔗糖的質(zhì)量變化

按照1.3.4中方法對腸膜明串珠菌轉(zhuǎn)化液進(jìn)行取樣分析，采用式（1）計算不同時間轉(zhuǎn)化液中的蔗糖質(zhì)量，結(jié)果見圖2。

圖2　不同時間轉(zhuǎn)化液中的蔗糖質(zhì)量Fig.2　The quality of sucrose at different time culture liquid

由圖2可知，在接種前期蔗糖質(zhì)量變化較為平緩，6 h～12 h之間蔗糖質(zhì)量急劇下降且12 h時基本轉(zhuǎn)化完全，12 h后變化平緩且最終為0。這是因為接種前期是腸膜明串珠菌生長的潛伏期，故變化不大，6 h后進(jìn)入生長對數(shù)期，這時菌體快速生長蔗糖消耗極快，12 h后進(jìn)入平穩(wěn)期。因此，后續(xù)試驗以12 h作為反應(yīng)終點(diǎn)對蔗糖轉(zhuǎn)化率進(jìn)行分析。

2.3　單因素試驗

2.3.1　蔗糖濃度對蔗糖轉(zhuǎn)化率的影響

改變發(fā)酵培養(yǎng)液中蔗糖濃度為 50、60、80、90、100 g/L，蛋白胨、Na2HPO4、KH2PO4分別為 7、1.4、0.3g/L，以接種時為轉(zhuǎn)化起點(diǎn)，在28℃、150 r/min搖床反應(yīng)器中轉(zhuǎn)化12 h后取樣分析，考察蔗糖濃度對蔗糖轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3　蔗糖濃度對蔗糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3　The change of sucrose concentration on the influence of sucrose conversion

由圖3可知，當(dāng)蔗糖濃度不超過80 g/L時，在12 h內(nèi)蔗糖基本能夠轉(zhuǎn)化完全，轉(zhuǎn)化率較高；后隨著蔗糖濃度的增大，蔗糖轉(zhuǎn)化率降低，這是因為發(fā)酵液中過高的蔗糖濃度會影響菌體的生長，所以選擇蔗糖濃度為80 g/L。

2.3.2　搖床轉(zhuǎn)速對蔗糖轉(zhuǎn)化率的影響

按照1.3.1中配制腸膜明串珠菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值為7.1，反應(yīng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速分別為 0、50、100、150、200 r/min，以接種時為轉(zhuǎn)化起點(diǎn)培養(yǎng)12 h后取樣，試驗結(jié)果如圖4。

圖4　搖床轉(zhuǎn)速對蔗糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4　The change of shaking speed on the influence of sucrose conversion

由圖4可知，搖床轉(zhuǎn)速對蔗糖轉(zhuǎn)化率影響較小，低轉(zhuǎn)速時蔗糖轉(zhuǎn)化率較高，隨著轉(zhuǎn)速的升高，蔗糖轉(zhuǎn)化率略有降低。搖床轉(zhuǎn)速主要通過改變培養(yǎng)液中的溶氧量及傳質(zhì)過程來影響腸膜明串珠菌，氧氣過多時會抑制其生長，增大搖床轉(zhuǎn)速會增大發(fā)酵液中的溶氧量和物質(zhì)之間的剪切力從而影響菌體生長，因此蔗糖轉(zhuǎn)化率有所降低，綜合考慮，轉(zhuǎn)速選擇100 r/min。

2.3.3　溫度對蔗糖轉(zhuǎn)化率的影響

按照1.3.1中配制腸膜明串珠菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值為7.1，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)溫度分別為 20、25、30、35、40 ℃，以接種時為轉(zhuǎn)化起點(diǎn)培養(yǎng)12 h后取樣，試驗結(jié)果如圖5。

圖5　溫度對蔗糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5　The change of temperature on the influence of sucrose conversion

由圖5可知，溫度變化對蔗糖轉(zhuǎn)化率影響較大，隨著溫度的升高蔗糖轉(zhuǎn)化率先增大后減小，在30、35℃時蔗糖轉(zhuǎn)化率較高。溫度主要通過影響右旋糖酐蔗糖酶的活性來影響蔗糖轉(zhuǎn)化率，溫度過低會使得酶催化反應(yīng)速率變慢，過高會使酶變性或失活，因此后續(xù)反應(yīng)溫度選擇30℃。

2.3.4　初始pH值對蔗糖轉(zhuǎn)化率的影響

按照1.3.1中配制腸膜明串珠菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液 pH 值分別為 6.1、6.5、7.1、7.6、8.0，搖床反應(yīng)條件28℃，150 r/min，以接種時為轉(zhuǎn)化起點(diǎn)培養(yǎng)12 h后取樣，試驗結(jié)果如圖6。

圖6　初始pH值對蔗糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6　The change of initial pH on the influence of sucrose conversion

由圖6可知，蔗糖轉(zhuǎn)化率隨初始pH值的升高先增大后降低且在pH值為7.1的時候有最大值。pH值的變會化引起菌體細(xì)胞膜電荷發(fā)生改變而影響菌體的生長，同時pH值變化會影響右旋糖酐蔗糖酶的活性。后續(xù)反應(yīng)中初始pH值選擇7.1。

2.4　響應(yīng)面法優(yōu)化腸膜明串珠菌發(fā)酵工藝條件

在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法考察蔗糖濃度、搖床轉(zhuǎn)速、溫度、初始pH值對蔗糖轉(zhuǎn)化率的交互影響，以蔗糖轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值Y，設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計見表1。

表1　響應(yīng)面試驗因素及水平表Table 1　Factors and levels of response surface method

表2　響應(yīng)面設(shè)計及試驗結(jié)果Table 2　The design of experiment and result of response surface

通過Design Expert軟件對表2中試驗結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到下列二次多元回歸方程：

對上述二次多元回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3　回歸模型方差分析表Table 3　Variance analysis for the regression model

由表3可知，回歸擬合模型（Pr＞F）值＜0.000 1，擬合模型極顯著；實驗的失擬項（Pr＞F）=0.069 9＞0.05，差異不顯著，表示此模型合理且不再引入更高次的項；模型擬合系數(shù)R2為0.999 5，調(diào)整R2為0.999，擬合模型能闡明99.9%的響應(yīng)值的改變。變異系數(shù)為0.54%，較小，說明擬合模型置信度較高。因此擬合模型用于右旋糖酐合成的培養(yǎng)工藝條件分析和預(yù)測是可靠的。由表3中F值大小可知，各因素對右旋糖酐收率影響強(qiáng)度為C＞A＞B＞D。因素A、B、C、D的交互作用與產(chǎn)率的響應(yīng)面及其等高線見圖7。

圖7　各因素交互作用響應(yīng)面曲線圖Fig.7　Response surface of various factors interaction

圖7為各因素之間兩兩交互作用的響應(yīng)面曲線圖，從圖7及表3中可知，CD因素交互作用不顯著，AB、AC、AD、BC、BD因素之間交互作用顯著。從圖7可以看出初始pH值和溫度的交互作用對蔗糖轉(zhuǎn)化率的影響最大，隨著初始pH值和溫度的增大蔗糖轉(zhuǎn)化率也隨之增高。本試驗分析優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)工藝條件為蔗糖濃度69.58g/L、初始pH 6.92、溫度30.95℃、搖床轉(zhuǎn)速153.21 r/min，考慮到實際操作的可行性，調(diào)整后的培養(yǎng)工藝條件為蔗糖濃度70 g/L、初始pH 7.0、溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。

2.5　驗證試驗

根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果，按照蔗糖、蛋白胨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀濃度分別為70、7.0、1.4、0.3 g/L配制腸膜明串珠菌發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)整初始pH值為7.0，高溫滅菌后接入10%（質(zhì)量比）種子液，在搖床溫度30℃，轉(zhuǎn)速150 r/min條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)12 h，采用高效液相色譜法對培養(yǎng)液中的蔗糖進(jìn)行定量。進(jìn)行3次平行試驗，結(jié)果表明蔗糖轉(zhuǎn)化率為99.18%。

3　結(jié)論

通過腸膜明串珠菌（CICC-21725）培養(yǎng)工藝條件的單因素試驗及Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計試驗和分析得到右旋糖酐的培養(yǎng)工藝條件為：蔗糖濃度70 g/L、初始pH 7.0、溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。配置腸膜明串珠菌培養(yǎng)基，在優(yōu)化的培養(yǎng)工藝條件下反應(yīng)12 h，對轉(zhuǎn)化液中的蔗糖含量進(jìn)行分析，得到蔗糖的轉(zhuǎn)化率為99.18%，平行試驗的相對誤差較小，說明該條件可行且具有實際操作意義。

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