任路平 于賢 王娜 劉娜 宋光耀 陳樹春
河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科(石家莊 050000)
近年,人群中含果糖的軟飲料如可樂、果汁等的攝入量逐年增加,果糖對肝臟脂質(zhì)沉積的影響已逐漸被認(rèn)識。果糖主要在肝細胞內(nèi)代謝,我們的既往動物研究證明高果糖飲食可引起脂肪肝,并且和肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)[1-3]。激活轉(zhuǎn)錄因子4(ATF-4)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中非折疊蛋白反應(yīng)PERK-eIF2α-ATF-4通路的下游因子,已有研究發(fā)現(xiàn)ATF-4具有調(diào)節(jié)脂代謝的作用[4-5],但目前國內(nèi)尚無研究觀察ATF-4在果糖致肝臟脂質(zhì)沉積中的作用,探討ATF-4對果糖所致肝脂質(zhì)沉積的作用有助于進一步探索果糖對脂代謝的危害及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在脂肪肝中的介導(dǎo)機制。故本研究通過敲低ATF-4在HepG2細胞的表達,探討果糖致HepG2細胞脂質(zhì)沉積中ATF-4的介導(dǎo)作用及可能機制。
1.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人肝腫瘤系HepG2細胞(江蘇省江陰康眾康民生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司,批號:HUCL-0085)用含10%FBS,1%NEAA的MEM培養(yǎng)液于37℃含5%CO2的溫箱中培養(yǎng),待細胞80%生長融合。將處于對數(shù)生長期的細胞消化后,用含10%FBS,1%NEAA的MEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為106個/L,轉(zhuǎn)入孔板中,將ATF小干擾RNA(SiRNA)(Santa Cruz,CA,USA)轉(zhuǎn)染致HepG2細胞。
1.2 細胞分組 根據(jù)不同處理將細胞分為正常對照組(C組,普通培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細胞組);高果糖組(F組,含20 mmol/L果糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)的HepG2細胞組);高果糖+陰性對照組(F+NC組,含20 mmol/L果糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)的HepG2細胞轉(zhuǎn)染空白對照質(zhì)粒組);高果糖+ATF-4 siRNA組(F+ATF-4 siRNA組,含20 mmol/L果糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)的HepG2細胞轉(zhuǎn)染ATF-4 siRNA組)。
x代表基帶信號,M代表幾進制調(diào)制,本文的M取2和4。調(diào)制信號產(chǎn)生以后,再給調(diào)制信號加上高斯噪聲,模仿信號傳輸過程中的干擾。把調(diào)制信號加上高斯噪聲的函數(shù)如下:
1.3 HepG2細胞甘油三酯測定 收集細胞,制備細胞懸液,將細胞懸液1 000 r/min,離心10 min,棄上清液,留細胞沉淀;按照甘油三酯測定試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司)提供的操作方法,采用GPO-PAP法測定HepG2細胞內(nèi)甘油三酯含量。
1.6 HepG2細胞的蛋白表達測定 本實驗應(yīng)用Western Blot方法測定了ATF-4及下游脂質(zhì)合成的關(guān)鍵酶類脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、硬脂酰CoA去飽和酶(SCD-1)的蛋白表達水平。提取HepG2細胞總蛋白,取50 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳,經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉,加入1∶1 000~1∶2 000稀釋的抗體,4℃搖床過夜,TTBS緩沖液洗膜后加入1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體孵育1 h,經(jīng)化學(xué)發(fā)光,顯影,定影及蛋白表達半定量分析。FAS抗體購于Santa Cruz公司,SCD-1、ACC、ATF-4抗體購于美國Cell Signal Technology公司,抗β-actin小鼠單克隆抗體購于SAB公司。
2.1 轉(zhuǎn)染ATF-4 siRNA對ATF-4蛋白表達的影響 F組ATF-4表達較C組顯著升高(P<0.01),提示果糖刺激引起HepG2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路PERK-eIF2α-ATF-4的激活。F+ATF-4 siRNA組ATF-4的表達水平比F組顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明ATF-4表達水平被有效抑制(圖1)。