布俏雯 張亮 王三鋒 馬健 胡桂英 伍恒英 羅喜平

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省婦幼保健院婦科（廣州 510010）

宮頸癌是世界范圍內(nèi)繼乳腺癌及直腸癌后的第三大女性惡性腫瘤，每年約有500 000的新發(fā)病例，造成250 000例死亡［1］。因此能盡早發(fā)現(xiàn)宮頸病變，對(duì)宮頸癌的預(yù)防和治療有重要意義。目前主要通過液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測（thinprep cytologic test，TCT）和HPV聯(lián)合檢測手段篩查宮頸癌。但TCT敏感性較低，造成較高的假陰性率，聯(lián)合HPV檢測雖然提高了發(fā)現(xiàn)CIN2+以上病變的靈敏度，但是特異度仍較低。最新研究［2］發(fā)現(xiàn)聯(lián)合DNA甲基化檢測技術(shù)既能保持診斷宮頸病變的靈敏度，又能提高特異性。因此，將靶基因甲基化檢測技術(shù)應(yīng)用到宮頸癌的早期篩查中能提高宮頸病變的檢出率。研究［3］表明在宮頸癌及癌前病變中，宿主基因DNA甲基化導(dǎo)致抑癌基因沉默，從而導(dǎo)致癌變。因此，尋找在宮頸癌中高甲基化而在正常宮頸中非甲基化的特異性分子標(biāo)志物，補(bǔ)充目前宮頸癌早期篩查方法的不足，具有重要意義。國外已有研究［4-5］發(fā)現(xiàn)在宮頸細(xì)胞中，F(xiàn)AM19A4基因甲基化能作為新型的腫瘤標(biāo)記物，高效鑒別宮頸癌與正常宮頸組織。但國內(nèi)目前尚無FAM19A4基因啟動(dòng)子甲基化在宮頸癌及其癌前病變?cè)\斷中應(yīng)用價(jià)值的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用雙探針熒光定量PCR技術(shù)檢測正常宮頸組織、宮頸HSIL及宮頸癌組織中FAM19A4基因的甲基化情況，并比較該甲基化情況在宮頸癌的不同臨床特征中的差異，分析該基因的甲基化在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 資料來源 隨機(jī)收集2017年1月至2017年8月間就診于我院，分別因?qū)m頸癌、宮頸HSIL、子宮脫垂行子宮切除術(shù)的甲醛固定-石蠟包埋組織（formalin-fixed and paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）標(biāo)本，經(jīng)我院2名以上病理醫(yī)師分別診斷為宮頸癌、宮頸HSIL（CIN3）及正常宮頸共76例（分別為31例、22例和23例）。不同宮頸病變組別平均年齡分別為：（47.42 ± 9.34），（42.45 ± 9.06），（48.30 ± 12.32）歲，年齡間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取 利用TIANamp FFPE DNA提取試劑盒（北京天根公司生產(chǎn)）提取石蠟包埋標(biāo)本的DNA，按試劑盒說明書提供的方法操作。以上提取的DNA使用Quawell Q5000紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測量，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.2 重亞硫酸鹽修飾 將提取的DNA進(jìn)行重亞硫酸氫鹽處理（模板DNA濃度為500 ng），利用EZ DNA Methylation-DirectTM試劑盒（美國Zymo Research公司產(chǎn)品），按試劑盒說明書提供的方法操作。重亞硫酸鹽修飾后的DNA立即用于熒光定量PCR檢測，剩余樣本儲(chǔ)存在-20℃冰箱。

1.2.3 雙探針熒光定量PCR 美國ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Life Tech）用于進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測宮頸細(xì)胞刷液中FAM19A4基因的甲基化情況。以宮頸癌FFPE-DNA、正常外周血DNA、雙蒸水分別作為陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照模板。反應(yīng)體系共20 μL，主要包括：2×Premix Type試劑10 μL；50 × Rox Reference Dye II試劑0.2 μL；FAM19A4基因上、下游引物各0.5μl；ACTB內(nèi)參基因上、下游引物各0.5 μL；FAM19A4基因及ACTB內(nèi)參基因探針各0.8 μL；純水5.2 μL；樣本量1 μL（FAM19A4基因及ACTB內(nèi)參基因的引物及探針序列如表1所示）。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；然后95℃變性15 s，56℃退火20 s及65℃延伸40 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本均進(jìn)行了3次重復(fù)試驗(yàn)。擴(kuò)增結(jié)果判定：熒光定量PCR技術(shù)擴(kuò)增后，經(jīng)ABI 7500收集熒光信號(hào)，獲得內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的循環(huán)閾值（CT值）及擴(kuò)增曲線（宮頸癌、正常宮頸及空白對(duì)照的擴(kuò)增曲線如圖1所示），計(jì)算兩基因CT值間的閾值差（ΔCT），綜合判定不同樣本的甲基化程度。以ACTB為內(nèi)參，計(jì)算ΔCT=CT目標(biāo)基因-CT內(nèi)參，并同時(shí)結(jié)合擴(kuò)增曲線判斷甲基化情況，且ΔCT值越小，擴(kuò)增曲線目標(biāo)基因越早擴(kuò)增，表示基因甲基化水平越高。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計(jì)數(shù)資料采用Pearson卡方檢驗(yàn)或連續(xù)校正或Fisher精確概率法，α=0.05；其中組內(nèi)兩兩比較采用Bonferroni校正。線性趨勢(shì)采用Cochran-Armitage趨勢(shì)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 FAM19A4及ACTB基因的引物及探針序列Tab.1 The sequences of primers and probes for the FAM19A4 and ACTB genes

2 結(jié)果

2.1 比較不同嚴(yán)重程度宮頸病變FFPE樣本的FAM19A4基因啟動(dòng)子甲基化檢出率的差異 采用雙探針熒光定量PCR分別檢測宮頸癌、宮頸HSIL和正常宮頸組織FFPE中FAM19A4基因啟動(dòng)子發(fā)生甲基化的情況，發(fā)現(xiàn)在31例宮頸癌FFPE中FAM19A4基因甲基化檢出率最高（96.8%），22例宮頸HSIL組織有16例發(fā)生甲基化（72.7%），21例正常宮頸組織僅2例發(fā)生甲基化（8.7%），3組間甲基化檢出率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。接著進(jìn)行組內(nèi)兩兩比較，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)宮頸癌組的FAM19A4基因甲基化檢出率高于宮頸HSIL組（96.8%vs.72.7%，P＜0.05）；宮頸癌組的FAM19A4基因甲基化檢出率高于正常宮頸組（96.8%vs.8.7%，P＜0.05）；宮頸HSIL組的FAM19A4基因甲基化檢出率高于正常宮頸組（72.7%vs.8.7%，P＜0.05）。見表2。

圖1 宮頸癌、正常外周血DNA及空白對(duì)照樣本的的擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curves of cervical cancer,normal peripheral blood DNA and blank control samples

表2 宮頸癌與非癌病變FFPE組織中FAM19A4基因啟動(dòng)子甲基化檢出率的比較Tab.2 Comparison of detection rates of FAM19A4 gene promotor methylation in FFPE tissues of cervical cancer and non-cancerous lesions

采用Cochran-Armitage趨勢(shì)檢驗(yàn)判斷宮頸病變程度與FAM19A4甲基化之間是否存在線性趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)二者間存在線性趨勢(shì)（χ2=42.572，P＜0.05），即從正常宮頸到癌前病變?cè)龠M(jìn)展為宮頸癌，隨著宮頸病變嚴(yán)重程度增加，F(xiàn)AM19A4基因甲基化的檢出率逐漸升高。

2.2 宮頸癌不同臨床病理特征與FAM19A4基因啟動(dòng)子甲基化檢出率間的關(guān)系 31例宮頸癌患者的平均年齡為47.42歲，宮頸癌的年齡分組、組織學(xué)分型、臨床分期（FIGO，2009年）、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的分組情況如下表所示，發(fā)現(xiàn)宮頸癌不同年齡段、病理類型、臨床分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的FAM19A4基因啟動(dòng)子的甲基化檢出率間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 宮頸癌臨床病理特征與FAM19A4基因啟動(dòng)子甲基化檢出率間的關(guān)系Tab.3 Relationship between clinicopathological characteristics of cervical cancer and the detection rates of FAM19A4 gene promoter methylation 例

3 討論

3.1 DNA甲基化與宮頸癌的關(guān)系及FAM19A4基因的功能介紹 宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率及病死率均較高，但發(fā)病機(jī)制仍不明確。高危型HPV（high risk human papillomavirus，hr-HPV）感染是宮頸癌及其癌前病變的主要致病原因，hr-HPV還能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生遺傳及表觀遺傳的改變導(dǎo)致癌變［6］。表觀遺傳改變是指無需改變基因核苷酸序列但能改變基表型的過程。研究表明，表觀遺傳水平發(fā)生變異的頻率是基因突變頻率的10倍［7］。因此，檢測表觀遺傳學(xué)變異診斷腫瘤具有更高的穩(wěn)定性、靈敏度和特異度。其中DNA甲基化是最常見的表觀遺傳學(xué)之一，由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）催化并維持，使DNA啟動(dòng)子CpG島中胞嘧啶殘基的C5轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶，進(jìn)一步導(dǎo)致基因的沉默失活［3］。研究［8］表明，DNA啟動(dòng)子甲基化與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為宮頸癌早期診斷的分子標(biāo)志。具有序列相似性的19家族（趨化因子（C-Cmotif）-樣）成員 A4（family with sequence similarity 19 member A4，F(xiàn)AM19A4）是TAFA基因家族成員，其編碼的細(xì)胞因子FAM19A4是一種分泌蛋白，是甲酰肽受體-1（FPR1）的配體，能趨化巨噬細(xì)胞，促進(jìn)吞噬酵母聚糖并增加ROS釋放。研究發(fā)現(xiàn)FAM19A4在正常組織中呈低表達(dá)，而在單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬及遷移作用，調(diào)控炎癥感染及應(yīng)激反應(yīng)［9-10］。

3.2 FAM19A4基因甲基化檢測在宮頸癌診斷中的臨床意義 STEENBERGEN等［4］首先使用人染色體核型分析技術(shù)在宮頸組織水平驗(yàn)證了FAM19A4基因啟動(dòng)子甲基化有望作為宮頸癌的新型靶向分子標(biāo)記物。研究發(fā)現(xiàn)其在宮頸癌及正常宮頸組織中的檢出率存在明顯表達(dá)差異（84%vs.5%），其中鱗癌與腺癌分別占91%（39/43）和73%（19/26）。本研究也發(fā)現(xiàn)了，與正常宮頸組織相比，F(xiàn)AM19A4基因甲基化檢出率在宮頸癌組織中異常增高（8.7%vs.96.8%），與文獻(xiàn)報(bào)道相似［4］。本研究在宮頸癌前病變中（HSIL），同樣檢測到較高水平的FAM19A4基因甲基化（72.7%），遠(yuǎn)高于STEENBERGEN等報(bào)道的10%（4/42），提示該基因甲基化同樣有望成為預(yù)測宮頸癌前病變的分子標(biāo)記物。此外，已有研究在宮頸細(xì)胞刷液或灌洗液中，發(fā)現(xiàn)FAM19A4基因甲基化也能有效檢測出宮頸癌及其癌前病變［5，11-13］。STROOPER 等［5］發(fā)現(xiàn)HPV感染持續(xù)5年以上的CIN2/3及宮頸癌病變中，均檢測出FAM19A4基因甲基化；而HPV感染持續(xù)不足5年的CIN2/3病變中，僅有42.1%檢測出FAM19A4基因甲基化。該研究表明FAM19A4甲基化水平隨著宮頸病變進(jìn)展而增高，該基因的甲基化檢測能預(yù)測不同程度的宮頸病變進(jìn)展為癌變的風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過趨勢(shì)檢驗(yàn)也進(jìn)一步說明了隨著宮頸病變嚴(yán)重程度增加，F(xiàn)AM19A4甲基化檢出率越高，F(xiàn)AM19A4基因甲基化可能促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，是宮頸細(xì)胞癌變的特異性生物標(biāo)志物。本研究也首次結(jié)合宮頸癌的臨床病理特征分析，發(fā)現(xiàn)FAM19A4基因甲基化均與年齡、病理類型、臨床分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無關(guān)。由此推測，F(xiàn)AM19A4基因甲基化是宮頸癌發(fā)生的早期事件，但可能與宮頸癌的生長活力及侵襲轉(zhuǎn)移特征無關(guān)。

3.3 FAM19A4基因甲基化檢測與傳統(tǒng)宮頸癌篩查技術(shù)（HPV分型及TCT）的比較 與細(xì)胞學(xué)及HPV16/18分流相比，F(xiàn)AM19A4基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)檢測CIN3及以上病變（≥CIN3）的靈敏度不明顯劣于前兩者，但特異度均顯著增高（分別為49.8%和57.4%vs.71.1%），有望成為hr-HPV陽性婦女的分流方案［13］。為了避免細(xì)胞學(xué)的額外取材，有研究將HPV16/18分型與FAM19A4基因甲基化結(jié)合用于檢測≥CIN3或≥CIN2病變，發(fā)現(xiàn)兩者結(jié)合雖然較單純甲基化檢測降低了特異度，但大大增加了靈敏度（分別為92%和76.5%）［11-12］。因此將HPV分型與靶基因甲基化檢測同時(shí)結(jié)合運(yùn)用于宮頸癌（前）的篩查，能顯著減少其漏診風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究從宿主基因水平的變化表明了宮頸組織可能受表觀遺傳影響發(fā)生癌變，但僅在組織水平驗(yàn)證了FAM19A4基因甲基化可能是宮頸癌病變的分子標(biāo)志物，并未從取材更為方便的宮頸細(xì)胞刷液水平做進(jìn)一步研究，更未進(jìn)行隨訪研究，論證發(fā)生FAM19A4基因甲基化的癌前病變是否具有更高進(jìn)展為惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，這是本研究不足之處。未來研究中擬從宮頸細(xì)胞刷液甚至自取宮頸細(xì)胞灌洗液出發(fā)，進(jìn)行前瞻性的隊(duì)列研究，探索FAM19A4基因甲基化與宮頸癌（前）病變的關(guān)系，希望將該基因甲基化檢測應(yīng)用在宮頸癌（前）病變的早期診斷中。

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