魏江存 陳勇 謝臻 秦祖杰 黃冬美 馬家寶

摘要：以橙皮苷為指標(biāo)性成分，建立六棱菊（Laggera alata）薄層鑒別和含量測(cè)定方法，比較廣西不同產(chǎn)地的六棱菊中橙皮苷含量。薄層色譜中可以檢出橙皮苷，斑點(diǎn)清晰，專屬性好。橙皮苷進(jìn)樣量在0.30～2.25 μg范圍（R2=0.999 6）呈良好的線性關(guān)系。六棱菊低、中、高加樣組橙皮苷的平均回收率分別為99.60%（RSD=2.78%）、99.97%（RSD=2.08%）和99.01%（RSD=1.36%）。廣西境內(nèi)10批不同產(chǎn)地的六棱菊中橙皮苷的含量差別較大，這可能與氣候、溫度、土壤、水分、光照等生長(zhǎng)條件有關(guān)。該方法能有效鑒別六棱菊，準(zhǔn)確測(cè)定橙皮苷含量，為開(kāi)發(fā)利用六棱菊資源提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：六棱菊（Laggera alata）;橙皮苷;薄層色譜法;高效液相色譜

中圖分類(lèi)號(hào)：S567.23+9? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）23-0139-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.23.033? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

六棱菊（Laggera alata）系菊科六棱菊屬植物，全草入藥，性苦、辛，微溫，有祛風(fēng)、除濕、解毒之功效，主要分布于中國(guó)東部、東南部至西南部，北至安徽和湖北[1，2]，因其新鮮的枝葉揉搓后散發(fā)特殊的臭味，在民間作為抗菌消炎、清熱解毒的良藥，云南民間稱之為“臭靈丹”[3]，以臭靈丹為主的許多復(fù)方制劑在臨床上應(yīng)用也取得較好的療效[4-8]。六棱菊常用于跌打損傷、燒燙傷、毒蛇咬傷、感冒咳嗽、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、皮膚濕疹和腹痛瀉痢等多種疾病[3]。目前，臨床多用于呼吸道疾病[9]、感冒[10]和病毒感染[11]等疾病的治療，但其有效成分尚不明確。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)六棱菊進(jìn)行了相關(guān)研究，試驗(yàn)表明[3，12-17]，六棱菊主要含黃酮類(lèi)、倍半萜類(lèi)和酚酸類(lèi)等化合物。目前，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)對(duì)其進(jìn)行薄層鑒別和含量測(cè)定的相關(guān)研究，為保證其藥材質(zhì)量及臨床療效，本試驗(yàn)建立了六棱菊橙皮苷的薄層鑒別和含量測(cè)定方法，為建立六棱菊活性成分科學(xué)、合理、可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

橙皮苷是極有藥用價(jià)值的天然資源，研究表明[18，19]，橙皮苷在抗氧化、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心肌缺血、血脂調(diào)控、抗血栓、降血壓及抗心律失常等心血管保護(hù)作用方面均有較好的效果，中國(guó)擁有豐富的橙皮苷資源，測(cè)定六棱菊中橙皮苷的含量，并比較廣西不同產(chǎn)地六棱菊中橙皮苷的含量差異，以完善六棱菊的質(zhì)量控制。

本研究將同時(shí)對(duì)廣西境內(nèi)10批不同產(chǎn)地的六棱菊進(jìn)行橙皮苷的薄層鑒別和對(duì)其含量測(cè)定，為六棱菊藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，也為研究六棱菊藥材的質(zhì)量控制新方法奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 儀器

2695型高效液相色譜儀（包括2489UV，四元泵、真空脫氣泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和Empower3液相工作站），美國(guó)Waters公司;Simplicity超純水系統(tǒng)，密理博中國(guó)有限公司;Practum224-1CN分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;尼龍66（Nylon）-22 μm微孔濾膜，天津津騰。

1.2? 試藥

橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：170213，純度>98.0%，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司）;甲醇為色譜純（Fisher， 4 L）;乙醇、磷酸、醋酸和其他試劑為分析純，試驗(yàn)用水為去離子水。六棱菊藥材采摘于廣西賀州市昭平縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室老師鑒定為菊科六棱菊屬植物六棱菊的全草。薄層硅膠G板，青島海洋化工廠。試驗(yàn)所有樣品（表1）執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)均為2015年版《中國(guó)藥典》一部。

1.3? 方法

1.3.1? 六棱菊樣品制備? ?采集六棱菊全草，自然曬干后，將其粉碎過(guò)三號(hào)篩，備用。

1.3.2? 薄層鑒別? 稱取六棱菊藥材粉末5 g，加75%乙醇100 mL，回流1 h，濾過(guò)，濾液揮干加甲醇3 mL使其溶解，作為六棱菊供試品溶液。取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解，配制成0.32 mg/mL的對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水體積比為100∶18∶12為展開(kāi)劑，展開(kāi)5 cm，取出，晾干，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20∶10∶1∶1）的上層溶液作為展開(kāi)劑，展開(kāi)12 cm，取出晾干，噴1%的三氯化鋁試液，置325 nm紫外光燈下檢視。

1.3.3? 陰性對(duì)照溶液的制備? 量取75%乙醇100 mL，回流1 h，濾過(guò)，濾液揮干加甲醇3 mL使其溶解，將其作為陰性對(duì)照溶液。

1.3.4? 對(duì)照品溶液制備? 精密稱取橙皮苷3.75 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得橙皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液，濃度為0.15 mg/mL。

1.3.5? 供試品溶液制備? 精密稱取六棱菊藥材粉末1.0 g，75%乙醇提取，回流，以半徑0.65 cm，13 000 r/min離心10 min，取上清液0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

1.3.6? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備? 精密吸取橙皮苷對(duì)照品溶液（濃度為150 μg/mL）2、5、8、10、12、15 μL注入液相色譜儀，以峰面積和進(jìn)樣量（μg）分別為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 薄層鑒別

薄層鑒別結(jié)果檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置處，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照色譜在相應(yīng)位置處無(wú)干擾（圖1）。

2.2? 色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.60 mm× 250 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-0.5%醋酸（36∶64），檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，按照上述條件各組分分離度良好（圖2）。

2.3? 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在“1.3.6”條件下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=2.0×106X-15 721（R2=0.999 6）。表明橙皮苷進(jìn)樣量在0.30～2.25 μg呈良好的線性關(guān)系。

2.4? 精密度試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液適量（150 μg/mL），按“2.2”項(xiàng)的條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算橙皮苷峰面積的 RSD為0.23%，小于3%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.5? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批六棱菊藥材粉末1.0 g，按“1.3.5”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在0、2、4、8、12、24 h后按“2.2”項(xiàng)的條件測(cè)定，計(jì)算六棱菊峰面積的RSD為2.948%，小于3%，說(shuō)明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.6? 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批六棱菊藥材粉末1.0 g，精密稱定，共6份，按“1.3.5”項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)的條件測(cè)定，計(jì)算六棱菊橙皮苷平均含量為0.782 3 mg/g，其RSD為2.86%，小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7? 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批已知含量的六棱菊藥材粉末（含量為0.782 3 mg/g），共9份，分成3組，即低、中、高加樣組（0.5 g藥材含量的80%、100%和120%加樣，加樣量分別為0.312 0、0.391 5、0.469 5 mg），六棱菊低、中、高加樣組的橙皮苷的平均回收率分別為99.60%、99.97%、99.01%，RSD分別為2.78%、2.08%、1.36%（n=3），表明該方法準(zhǔn)確性良好（表2）。

2.8? 樣品含量測(cè)定

精密稱取六棱菊藥材粉末（過(guò)3號(hào)篩）1.0 g，按“1.3.5”項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算橙皮苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3? 小結(jié)與討論

3.1? 流動(dòng)相的考察

考察了不同甲醇-酸水系統(tǒng)和乙腈-酸水系統(tǒng)（0.05%磷酸、0.1%磷酸、0.2%磷酸、0.5%冰醋酸、0.2%冰醋酸和去離子水），結(jié)果表明，甲醇-0.5%冰醋酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，分離度相對(duì)較好，基線較平穩(wěn)，出峰時(shí)間適當(dāng)，故流動(dòng)相確定為甲醇-0.5%冰醋酸水溶液。

3.2? 波長(zhǎng)的考察

采用二極管陣列檢測(cè)器，在200～400 nm波長(zhǎng)下對(duì)樣品和對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，橙皮苷在283和325 nm下有最大吸收。在283和325 nm檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，325 nm基線漂移以及雜峰較多，而用 283 nm時(shí)，基線相對(duì)平穩(wěn)，雜峰較少，溶劑峰小，橙皮苷響應(yīng)值較大，故最終采用283 nm作為本試驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3? 小結(jié)

廣西不同產(chǎn)地的六棱菊藥材均含有橙皮苷，且橙皮苷含量差異較大，百色田東縣所產(chǎn)的六棱菊藥材所含橙皮苷含量最高，其次是廣西富川縣和廣西賓陽(yáng)縣，而廣西百色靖西市和南寧上林縣橙皮苷含量最低。

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