李紅英 王曉輝 覃大吉 向極釬１，楊永康１，陳菲菲１，萬海英１，周 敏２，朱 麟１

摘要：采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對湘鄂地區(qū)6個不同區(qū)域的野生三葉木通[Akebia trifoliata（Thunb.） Koidz.]進(jìn)行了遺傳多樣性研究。從50個隨機(jī)引物中篩選出10個條帶清晰、多態(tài)性明顯并且重復(fù)性好的引物，共擴(kuò)增出86條DNA片段，其中73條為多態(tài)性條帶，占總擴(kuò)增帶數(shù)的84.9%。利用NTSYS軟件進(jìn)行聚類分析，以相似系數(shù)0.578為標(biāo)準(zhǔn)，可將所有品種分為3類，第Ⅰ大類包括恩施紅廟（紫色型）和湖南古丈（麻色型）;第Ⅱ類包括建始花坪、巴東茶店子和宣恩椒園;恩施太陽河的獨(dú)立分為第Ⅲ類。

關(guān)鍵詞：三葉木通[Akebia trifoliata（Thunb.） Koidz.];野生資源;RAPD;親緣關(guān)系

中圖分類號：Q37? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）23-0148-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.23.035? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

三葉木通[Akebia trifoliata（Thunb.） Koidz.]隸屬于木通科木通屬，俗稱預(yù)知子、八月瓜，落葉藤木，長可達(dá)10 m。多生長于海拔350～1 600 m的山地、山坡、山谷、溪邊、密林或疏林灌叢較陰濕地。分布于長江流域各省以及甘肅、河北等省。小枝褐色或暗褐色，疏生淡黃褐色皮孔;莖枝無毛。三葉復(fù)葉，小葉卵形，邊緣具波狀圓齒或淺裂，側(cè)脈一般5～6對，頂葉較小，基部偏斜?？偁罨ㄐ?，花單性，暗紫紅色。果為肉質(zhì)果，橢圓形，稍彎曲，種子多數(shù)，扁平卵圓形，黑色?；ㄆ?月，果期8—9月。本種果實(shí)含有糖類，種子含脂肪油43%。根、藤莖及果實(shí)、種子均可入藥。種子可榨油;果實(shí)熟后可食用。

RAPD是美國的Williams與Welsh 2個研究小組于1990年同時(shí)提出的1種DNA分子標(biāo)記技術(shù)[1，2]。RAPD技術(shù)建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，用一系列（通常數(shù)百個）不同的隨機(jī)排列堿基序列的寡核苷酸單鏈（一般為8～10 bp）作為引物，對所研究的基因組DNA進(jìn)行單引物擴(kuò)增，然后用凝膠電泳分離擴(kuò)增片段，經(jīng)染色來顯示擴(kuò)增DNA片段的多態(tài)性，擴(kuò)增片段多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性[3]。相對于傳統(tǒng)的酶學(xué)、RFLP等方法，RAPD標(biāo)記具有操作快速、簡便、多態(tài)性豐富、適應(yīng)性廣等諸多優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位，特別是遺傳多樣性的檢測[4]和品種分類、親緣關(guān)系鑒定和病毒檢測、優(yōu)良性狀及抗體篩選等方面[5]。由于RAPD標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用隨機(jī)引物，當(dāng)對大量試驗(yàn)材料進(jìn)行研究時(shí)，往往首先要對引物進(jìn)行篩選[6]。為此，試驗(yàn)以湘鄂6個不同區(qū)域的三葉木通為材料，通過RAPD標(biāo)記技術(shù)對50個10堿基的隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，以期為應(yīng)用RAPD標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行三葉木通的遺傳多樣性分析、品種分子鑒別、構(gòu)建遺傳指紋圖譜及分子標(biāo)記輔助育種等研究奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

1.1.1? 供試樣品? 供試樣品為2017年收集的湘鄂6個不同地區(qū)三葉木通類群的鮮葉，具體信息見表1。

1.1.2? 主要儀器? 高壓蒸汽滅菌鍋（上海東亞容器01J2003-04）、超低溫冰箱（SANYO MDF-392）、冰箱（Hair 208K/ANCINA）、制冰機(jī)（SCOTSMAN DA24845-3）、PCR擴(kuò)增儀（德國Eppendorf 5331）;高速低溫離心機(jī)（德國Eppendorf 5417R）、電泳儀（北京六一DYY-4C）、渦旋振蕩器（美國Scientific Industries Vortex-Genie 2）、電子天平（賽多利斯Secura？誖）、凝膠成像系儀器（美國伯樂 Gel Doc 200）、超微量紫外可見分光光度計(jì)（北京普析TU-1810）。

1.1.3? 引物及試劑? 試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的RAPD引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增所用試劑購于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 基因組DNA的提取? 三葉木通DNA提取使用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extration Kit。取葉片100 mg，液氮研磨后加入500 μL的Buffer HS I和10 μL的50×DTT Buffer混勻，然后加入10 μL的RNase A（10 mg/mL），充分振蕩混勻，于56 ℃水浴溫育10 min;加入62.5 μL的Buffer KAC（Buffer HS I或Buffer HS II的1/8體積），充分混勻，冰上放置5 min;12 000 r/min離心5 min，取上清，加入與上清液等體積的Buffer GB，充分混勻，將Spin Column安置于Collection Tube，溶液移至 Spin Column中（由于溶液較多，一般需要分兩次過柱，每次過柱的體積量不要超過700 μL），12 000? ? r/min離心1 min，棄濾液;將500 μL的Buffer WA加入至Spin Column中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液;將700 μL的Buffer WB加入至Spin Column中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液（沿Spin Column管壁四周加入Buffer WB，這樣有助于完全沖洗沾附于管壁上的鹽分）;重復(fù)上一個步驟;將Spin Column安置于Collection Tube上，12 000 r/min離心2 min;將Spin Column安置于新的1.5 mL的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入30～50 μL的Elution Buffer或滅菌水，室溫靜置5 min（將? Elution Buffer或滅菌水加熱至65 ℃時(shí)使用有利于提高洗脫效率）;12 000 r/min離心2 min洗脫DNA。用超微量紫外可見分光光度計(jì)和1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的純度與濃度。

1.2.2? RAPD PCR擴(kuò)增? 反應(yīng)體系總體積25 μL，含有1 μL基因組DNA（30 ng），1 μL引物（5 μmol/L），2.5 μL 10×PCR buffer反應(yīng)緩沖液，2 μL MgCl2（25 mmol/L），2 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.2 μL Taq酶，用ddH2O補(bǔ)充體積至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，35.5 ℃退火1 mins，72 ℃延伸1 min，38個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.3%的瓊脂糖凝膠電泳分離，電壓110 V，電泳35 min，在凝膠成像儀上觀察照相、記錄。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)各分子在相同電泳遷移率（相同分子量片段）的有無，統(tǒng)計(jì)得到所有條帶的二元數(shù)據(jù)，有DNA擴(kuò)增條帶記為“1”，無帶記為“0”，利用Ntsys計(jì)算出遺傳相似系數(shù)、構(gòu)建聚類圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 三葉木通基因組DNA的提取結(jié)果

由圖1可知，提取的DNA經(jīng)1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰，表明DNA質(zhì)量滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

2.2? 引物擴(kuò)增結(jié)果

進(jìn)行引物的篩選也是進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵，本試驗(yàn)選取了上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的50種隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，在合適的PCR擴(kuò)增條件下，一些引物如M04、S07、S08、S15、S16無擴(kuò)增條帶，而S11、S13、S29、S32、S40、S43、S44、S47、S49、S50擴(kuò)增譜帶清晰且多態(tài)性好擴(kuò)增范圍廣泛，都在7條帶及以上，所以選取這10種引物用于親緣關(guān)系分析（表2）。

2.3? 親緣關(guān)系分析

在建立合適的RAPD反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，從50個10 bp隨機(jī)引物中選用最好的引物S11、S13、S29、S32、S40、S43、S44、S47、S49、S50用于正式擴(kuò)增，對6個供試的三葉木通葉片基因組DNA擴(kuò)增出10張指紋圖譜，共獲得86條DNA譜帶，其中73條多態(tài)性帶，占總擴(kuò)增帶數(shù)的84.9%，每個引物擴(kuò)增的帶數(shù)在7～11條，平均為8.6條，擴(kuò)增出的DNA片段大小在100～1 000 bp，表3為所選的10種引物擴(kuò)增結(jié)果。

圖2至圖11為引物S11、S13、S29、S32、S40、S43、S44、S47、S49、S50的RAPD擴(kuò)增圖譜。10個指紋圖譜綜合分析結(jié)果表明，湖南古丈與恩施太陽河、宣恩椒園的共同點(diǎn)位很少，擴(kuò)增的條帶少，它們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而恩施紅廟與湖南古丈、建始花坪與巴東茶店子的擴(kuò)增帶的相似性很大且譜帶清晰，所擴(kuò)增的片段都在100～1 000 bp，它們的親緣關(guān)系較近。

2.4? 遺傳相似性分析

利用RAPD標(biāo)記擴(kuò)增DNA片段，通過Ntsys計(jì)算出遺傳相似系數(shù)（GS）。RAPD標(biāo)記揭示的6個地區(qū)三葉木通資源間的遺傳相似系數(shù)為0.434 1～0.682 9（表4），平均值為0.558 5。其中建始花坪（JS）與巴東茶店子（BD）GS值最大，為0.682 9，湖南古丈（HN）與恩施太陽河（TYH）GS最小，為0.434 1。

2.5? 聚類結(jié)果分析

由圖12可知，以相似系數(shù)0.578為標(biāo)準(zhǔn)，可將6個不同區(qū)域的三葉木通分為3大類，第Ⅰ大類包括恩施紅廟自選品種紫色型（ES）和湖南古丈麻色型（HN），它們之間的基因組差異不是很明顯，這很可能是由于自選品種恩施紅廟紫色型多年來對湖南古丈三葉木通進(jìn)行的品種選育和野轉(zhuǎn)家栽培造成的;第Ⅱ類包括宣恩椒園（XE）、巴東茶店子（BD）和建始花坪（JS）;恩施太陽河（TYH）獨(dú)立分為一類。

3? 小結(jié)

RAPD標(biāo)記技術(shù)是出現(xiàn)最早的分子標(biāo)記技術(shù)之一，其操作簡便、成本較低及不需要DNA的序列材料等特點(diǎn)是其他標(biāo)記技術(shù)無法比擬的[7]。但RAPD標(biāo)記也存在某些不足，其中最主要的是其靈敏度高，受反應(yīng)條件影響較大，檢測的重復(fù)性較差，因此，研究者在利用RAPD標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析時(shí)一定要嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件，采用穩(wěn)定優(yōu)化的反應(yīng)體系方能取得理想的試驗(yàn)結(jié)果[8]。同時(shí)，在運(yùn)用RAPD標(biāo)記技術(shù)時(shí)，由于每個隨機(jī)引物并不適合于所有物種，因此對引物的篩選是非常必要的，篩選出多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好的隨機(jī)引物是整個試驗(yàn)成功的關(guān)鍵[9]。

田宗城等[10]以七葉木桶、三葉木通、白木通、五葉木通等4個種的12個材料為研究對象，用RAPD技術(shù)對其進(jìn)行親緣關(guān)系分析，從40個隨機(jī)引物（10mer）中篩選出5個（S30、S168、S11、S12、S96），對所有供試材料進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得5張指紋圖譜，共在52個位點(diǎn)上擴(kuò)增出條帶，平均每個引物擴(kuò)增10.4個，多態(tài)位點(diǎn)43個，占總帶數(shù)的82.7%。而本試驗(yàn)以湘鄂地區(qū)6個不同區(qū)域的三葉木通為供試材料，更為系統(tǒng)地分析了三葉木通遺傳多樣性，從50個隨機(jī)的RAPD引物中成功篩選出10條多態(tài)性豐富、條帶清晰且可重復(fù)性好的有效引物，10條引物共擴(kuò)增出83條DNA條帶，其中84.9%為多態(tài)性條帶，這為應(yīng)用RAPD標(biāo)記技術(shù)快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行三葉木通遺傳多樣性分析和品種分子鑒別等研究奠定了良好基礎(chǔ)。

三葉木通分布于中國河北、山西、山東、河南、陜西南部、甘肅東南部至長江流域各省區(qū)。可見它分布遍布全國各地，樣品采集應(yīng)該來源于全國各地，而試驗(yàn)不足之處在于樣品采集的局限性，只收集了鄂湘6個不同區(qū)域，對三葉木通遺傳多樣性的研究不是很全面，但是卻為三葉木通種子資源的篩選與開發(fā)利用奠定了一定的基礎(chǔ)。

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