朱志賢 于翠 李勇 莫榮利 鄧文 胡興明

摘要：根據(jù)核盤菌菌核形成相關(guān)絲裂原活化蛋白激酶Smk1的氨基酸序列設(shè)計出簡并引物進行RT-PCR，克隆獲得長度為856 bp的桑椹縮小型菌核病菌絲裂原活化蛋白激酶基因Mmk1的cDNA片段。將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blastx比對后，發(fā)現(xiàn)克隆片段所編碼的氨基酸序列與其他真菌的MAPK氨基酸序列具有較高的同源性。實時熒光定量PCR分析表明，該基因的表達量隨著菌株的生長而減少。Mmk1基因的分子克隆為進一步研究其在菌核形成中的作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：桑椹縮小型菌核病菌;簡并引物;絲裂原活化蛋白激酶

中圖分類號：Q78;S888.71? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）23-0143-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.23.034? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

果桑是以產(chǎn)果為主、果葉兼用型桑樹的統(tǒng)稱，其果實桑椹具有豐富的營養(yǎng)和藥用價值，花青素含量極高，抗氧化功效明顯，具有促進造血細胞生長、降血糖、降血脂等藥理作用，被衛(wèi)生部列為“既是食品又是藥品”名單[1，2]。桑椹除直接食用外，目前已開發(fā)出果汁飲品、桑果酒、桑果醬、桑椹膏及花青素等產(chǎn)品，表現(xiàn)出巨大的產(chǎn)業(yè)發(fā)展?jié)摿蛷V闊的市場前景[3，4]。然而在果桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中，桑椹菌核病來勢猛、發(fā)病快，發(fā)病率高達30%～90%，有些果桑園甚至絕產(chǎn)[5]，桑椹菌核病已成為限制果桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。

桑椹菌核病又稱白果病，目前公認且常見的菌核病有桑椹肥大型菌核病、桑椹縮小型菌核病和桑椹小粒型菌核病3種，病原菌分別為桑實杯盤菌（Ciboria shiraiana）、桑椹核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）和肉阜狀杯菌（Ciboria carunculoides）[5，6]。菌核是桑椹菌核病菌越冬的重要場所，菌核隨病椹落地，到次年3月上、中旬桑雌花開放時，土壤中的菌核萌發(fā)形成子囊盤。子囊盤上子實層著生子囊和子囊孢子，子囊孢子是病害初侵染的主要來源[7]。因此，了解菌核形成相關(guān)的分子機制可以為病害防治提供理論依據(jù)。Chen等[8]從核盤菌中克隆到一個高度保守的ERK-type絲裂原活化蛋白激酶編碼基因（ERK-type mitogen-activated protein kinases from S. sclerotiorum，smk1），該基因在菌核形成起始階段的表達量達到最高，smk1基因沉默菌株不能形成成熟的菌核，其表達受到酸性誘導(dǎo)和外源環(huán)磷酸腺苷的抑制，說明smk1基因可通過MAPK途徑對環(huán)境信號作出反應(yīng)并調(diào)控菌核的形成。劉蒙蒙等[9]在豬苓中同樣克隆得到與smk1同源性為73%的ERK類型MAPK基因PuMAPK，實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明豬苓菌核形成初期，菌核中的MAPK表達量隨著菌核的快速生長而減少。MAPK是細胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，將細胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞及其核內(nèi)的重要傳遞者，其中信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular signal regulated protein kinases，ERKs）是MAPK家族中的3個成員之一[10]。ERKs有ERK1和ERK2兩種同工酶。一般認為，ERK主要在生長因子相關(guān)刺激引起的細胞反應(yīng)中起作用，主要參與細胞生長、分化和抗凋亡作用[9]。

近年來對桑椹菌核病的研究集中在病原菌鑒定，田間流行規(guī)律調(diào)查，農(nóng)業(yè)、化學防治及潛在生防菌株篩選方面[7，11-13]，無菌核形成相關(guān)機理的報道。本試驗根據(jù)已報道與核盤菌菌核形成相關(guān)的Smkl氨基酸保守序列設(shè)計簡并引物，克隆桑椹縮小型菌核病病菌的絲裂原活化蛋白激酶編碼基因（mitogen-activated protein kinases from Scleromitrula shiraiana，Mmk1），初步揭示其菌核形成分子機理，以期為開發(fā)高效專一性殺菌劑，切斷菌核病的病害循環(huán)提供理論依據(jù)，為病害防控提供新的思路和線索。

1? 材料與方法

1.1? 供試菌株

桑椹縮小型菌核病菌Sd1-2（GenBank accession number：MH298851）分離自宜昌市三斗坪鎮(zhèn)采集的病果;克隆菌株為大腸桿菌JM109（上海唯地生物技術(shù)有限公司）。

1.2? 試劑

質(zhì)粒為TaKaRa公司的pMD18TM-T vector，超純RNA提取試劑盒、RNA純化反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA kit、2×Es Taq Mastermix等試劑均為康為世紀公司產(chǎn)品，DNA回收試劑盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit ver.4.0、熒光定量PCR試劑盒SYBR？誖Premix Ex TaqTM購自TaKaRa公司，SYBR Green I核酸染料為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，瓊脂糖、蛋白胨、酵母膏等常規(guī)試劑購自上海生工公司。氨芐青霉素（Amp）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自北京酷來博科技有限公司，20 mg/mL X-gal購自賽國生物科技，引物合成和測序在擎科生物科技有限公司進行。

1.3? 簡并引物的設(shè)計和篩選

將核盤菌菌核形成相關(guān)的絲裂原活化蛋白激酶Smk1氨基酸序列在NCBI中進行Blastp比對，選取與其同源的代表性氨基酸序列采用ClustalX（version 1.83）對序列片段進行比對（alignment）[14]，設(shè)定參數(shù)如下：多重序列比對參數(shù)：起始空位罰分（gap opening）=10，延伸空位罰分（extension opening）=0.2，轉(zhuǎn)移權(quán)系數(shù)（transition weight）=0.5，延遲發(fā)散序列（delay divergent sequences）=30%，根據(jù)需要對比對結(jié)果進行校對[8]。登錄Blockmaker，對上述序列進行Block比對，從Block results界面登錄CodeHop數(shù)據(jù)庫，進行簡并引物設(shè)計[15]，利用Oligo 7.37對篩選的引物分析做進一步篩選。

1.4? RT-PCR擴增Mmk1基因片段

將Sd1-2菌株轉(zhuǎn)入鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板中央培養(yǎng)，25 ℃條件下培養(yǎng)20 d后收集菌絲。采用超純RNA提取試劑盒按說明書步驟提取其總RNA，用微量紫外分光光度計檢測合格后，用RNA 純化反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA kit去基因組DNA和反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用設(shè)計的簡并引物DMMK1-F/ DMMK1-R擴增Mmk1的cDNA片段，反應(yīng)在50 μL PCR體系中進行，包括2×Es Taq Mastermix 25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，模板cDNA 10 ng 1 μL，加入ddH2O至體系體積達50 μL。PCR擴增參數(shù)為：95 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán);72 ℃ 10 min。

1.5? RT-PCR產(chǎn)物的檢測、克隆與測序

PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外觀察，切取目的條帶，用TaKaRa回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物與pMD18TM-T vector進行連接后轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，然后在含有AMP、IPTG和X-gal的抗性LB固體培養(yǎng)基平板上37 ℃培養(yǎng)過夜，經(jīng)藍白斑篩選，挑取白色菌落，進行菌落PCR驗證，然后將陽性克隆送樣至擎科生物公司，采用載體通用引物M13-47/RV-M雙向測序分析。

1.6? Mmk1基因片段測序結(jié)果分析

測序后的片段在NCBI中進行Blastx比對，選取與其同源的代表性氨基酸序列用ClustalX（version 1.83）進行多序列比對，用MEGA 5.05軟件中的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，選用Jone-Taylor-Thomton（JTT）模型，進化樹用自展分析法進行檢驗，循環(huán)1 000次。

1.7? Mmk1基因表達分析

為了分析Mmk1基因在不同時間點的表達情況，提取了在PDA平板上培養(yǎng)7、14和21 d的菌株Sd1-2菌絲RNA。反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，根據(jù)克隆的Mmk1基因序列設(shè)計引物MMK1-F/MMK1-R：5′-ATCGTTCACCGAAGTCTACCTG-3′/5′-CTCTGTGT

AGGACGTTGGCAG-3′進行實時熒光定量PCR擴增。PCR反應(yīng)設(shè)定為10 μL總反應(yīng)體系，其中包括5 μL 2×SYBR？誖Premix ExTaqTM Master Mix，0.5 μL引物（2.5 μmol/L），0.2 μL ROX Reference Dye，1 μL cDNA模板和2.8 μL ddH2O。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)設(shè)定如下：95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后采用2-ΔΔCt法進行計算不同處理組的相對表達量，以β-tubulin基因（5′-TTGGA

TTTGCTCCTTTGACCAG-3′/5′-AGCGGCCATCATGT

TCTTAGG-3′）作為內(nèi)參基因，每個反轉(zhuǎn)錄樣品重復(fù)3次試驗。采用DPS（version 3.01）軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，并用LSD法比較不同處理間的差異顯著性（P<0.05）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 簡并引物的設(shè)計和篩選

將核盤菌菌核形成相關(guān)的絲裂原活化蛋白激酶Smk1氨基酸序列在NCBI中進行Blastp比對，選取與其同源的代表性菌株的MAPK氨基酸序列用ClustalX進行多序列比對（圖1），根據(jù)需要對比對結(jié)果進行校對，登錄Blockmaker進行Block比對，得到9個高度保守的連續(xù)氨基酸區(qū)域（Blocks），從Block results界面登錄CodeHop數(shù)據(jù)庫，進行簡并引物搜索，根據(jù)上、下游引物之間的Tm值和簡并度不能相差太大，簡并度控制在32以下;同時保證引物克隆足夠長的片段的原則。篩選出保守結(jié)構(gòu)域PFDHSMFCL和FFDFDKNKDNLT設(shè)計的上、下游引物DMMK1-F/DMMK1-R：5′-CCCATTCGATCAC

TCCatgttytgyyt-3′/5′-CAGGTTATCCTTGTGCTTATC Gaartyraaraa-3′，用Oligo 7.37對其分析未發(fā)現(xiàn)引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

2.2? RT-PCR擴增及擴增產(chǎn)物的克隆、測序

提取菌株Sd1-2的RNA（圖2），反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，用DMMK1-F/DMMK1-R為引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3，片段大小與預(yù)測結(jié)果大小基本一致。由瓊脂糖電泳檢測結(jié)果可見，這種引物的特異性較好，基本沒有非特異條帶。切膠后，用DNA回收試劑盒回收目標片段，連接載體轉(zhuǎn)化后，用通用引物M13-47/RV-M對轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR擴增驗證（圖4），將陽性克隆送樣測序。

2.3? Mmk1基因片段測序結(jié)果分析

利用設(shè)計的簡并引物進行RT-PCR，克隆到長度為856 bp cDNA片段（圖5）。測序后的片段在NCBI中進行Blastx比對，發(fā)現(xiàn)其與Sclerotinia sclerotiorum的MAPK氨基酸的同源性為99%，并都與已發(fā)表的其他真菌MAPK氨基酸高度同源。選取與其同源的代表性氨基酸序列用ClustalX（version 1.83）進行多序列比對，用MEGA 5.05軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明Mmk1序列與Sclerotinia sclerotiorum和Botrytis cinerea的MAPK氨基酸序列聚為一類（圖6）。

2.4? Mmk1基因表達的實時熒光定量PCR檢測

利用實時熒光定量PCR檢測了在PDA平板上培養(yǎng)7、14和21 d Sd1-2菌株（圖7A）Mmk1基因的表達量，發(fā)現(xiàn)Mmk1基因的相對表達量隨著菌株培養(yǎng)時間的延長而減少，但差異不顯著（圖7B）。

3? 小結(jié)與討論

本研究利用CodeHop設(shè)計的簡并引物DMMK1-F/DMMK1-R，經(jīng)RT-PCR擴增出特異片段，克隆獲得856 bp桑椹核地杖菌絲裂原活化蛋白激酶基因Mmk1的cDNA片段，Blastx比對發(fā)現(xiàn)Mmk1與核盤菌菌絲裂原活化蛋白激酶Smk1同源性為99%，系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)MMK1序列與Sclerotinia sclerotiorum和Botrytis cinerea的MAPK氨基酸序列聚為一類。實時熒光定量PCR結(jié)果表明該基因的表達隨著菌株的生長而減少。

由于S. shiraiana基因組序列未知，試圖用其他已經(jīng)發(fā)表的核盤菌Smk1引物[8，16]來擴增S. shiraiana中的Mmk1基因，但均未成功。經(jīng)過Blastn比對發(fā)現(xiàn)不同物種間MAPK基因核苷酸序列差異較大，而氨基酸序列相對保守。由于密碼子偏好性差異，不同的核酸序列可能表達出相同的氨基酸序列，而氨基酸序列才具有真正的保守性，因此采用氨基酸序列設(shè)計簡并引物。在CodeHop引物的簡并設(shè)計過程中，引物搜索后得到的結(jié)果中往往會出現(xiàn)大量的引物序列，這時合適的篩選方法和篩選工具尤為重要[17]。本試驗首先根據(jù)目標引物位置、片段長度、引物Tm值和簡并度對上、下游引物進行初次篩選，接著利用生物軟件Oligo7.37對初次篩選結(jié)果進行分析，這樣就能夠得到較優(yōu)化的引物對，使得試驗成功更有保證。

將克隆的Mmk1基因編碼的氨基酸序列與其他真菌MAPK氨基酸序列進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)Mmk1序列雖然與核盤菌、灰霉菌的MAPK氨基酸序列聚為一類，但是在不同分支上，核盤菌和灰霉菌卻在同一分支上。該結(jié)果與它們的分類地位一致，桑椹核地杖菌屬于地舌菌科核地杖菌屬，而灰霉屬于核盤菌科葡萄孢盤菌屬[18]，說明桑椹核地杖菌與核盤菌親緣關(guān)系較遠。該現(xiàn)象與蘇正川[11]報道類似，但王愛印[19]發(fā)現(xiàn)桑椹核地杖菌菌株SXSG-5在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)9周，可在培養(yǎng)基內(nèi)部產(chǎn)生黑色塊狀菌核，在查氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)12周，亦可在其內(nèi)部產(chǎn)生黑色顆粒狀菌核。鑒于本試驗未在PDA上發(fā)現(xiàn)菌株Sd1-2產(chǎn)生菌核，菌株在PDA平板上7 d左右才能看到有明顯的菌絲形成，14 d左右菌絲隨著菌株生長逐漸凝結(jié)形成凸起，21 d左右菌落上產(chǎn)生乳白色液體，鏡檢發(fā)現(xiàn)為該菌的分生孢子堆。這3個時間點菌株形態(tài)有較大變化，因此選擇這3個時間點檢測Mmk1基因的表達情況。核盤菌smk1和豬苓PuMAPK基因均是在菌核形成初期表達量最高，隨著菌核的生長而減少[8，9];Mmk1基因表達也是在菌絲凝結(jié)后逐漸減少，與核盤菌smk1和豬苓PuMAPK基因表達類似。本研究成功克隆了Mmk1基因部分cDNA片段，為下一步利用RACE等技術(shù)克隆該基因全長，通過RNAi等手段進一步研究該基因在桑椹縮小型菌核病菌菌核生長發(fā)育中的生物學功能提供了理論依據(jù)。

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