高涇尚 ，葉 懿，侯一平

（1.西藏自治區(qū)公安廳物證鑒定中心，西藏 拉薩 850000；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都610041）

短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）多態(tài)信息含量高，分型快速，是目前法庭科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的一類(lèi)遺傳標(biāo)記[1]。STR良好的多態(tài)性源于其在減數(shù)分裂過(guò)程中較高的突變率（1×10-3）[2]，也正因如此，日常檢案中 STR突變的現(xiàn)象并不罕見(jiàn)。當(dāng)被檢父和孩子有1～2個(gè)STR基因座不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律時(shí)，通常會(huì)考慮突變，并通過(guò)增加檢測(cè)其他高度多態(tài)性且遺傳穩(wěn)定的STR基因座，使累積父權(quán)指數(shù)（combined paternity index，CPI）達(dá)到認(rèn)定親權(quán)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)[3]。但是，若被檢父與可能的生父存在特殊的血緣關(guān)系（如父子關(guān)系、叔侄關(guān)系、同胞兄弟關(guān)系等），他們之間可能僅有個(gè)別STR基因座無(wú)相同的等位基因[4]，這種情形下，被檢父和孩子之間存在僅有1～2個(gè)STR基因座不符合遺傳規(guī)律的可能，在沒(méi)有檢測(cè)其他可疑親屬的情況下，得出認(rèn)定的結(jié)論，會(huì)有誤判的風(fēng)險(xiǎn)[5]。如果只能提供被檢父的樣品，則需要增加檢測(cè)多態(tài)性更好而且穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記，才能有效地排除近親屬。

在選擇多態(tài)性好且穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記方面，不少學(xué)者將處于一個(gè)單倍型區(qū)塊的遺傳標(biāo)記STR、單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入/缺失（insertion/deletion，InDel）組合成新的遺傳標(biāo)記，例如SNP-SNP[6]、SNP-STR[7]和Multi-InDel[8]等單倍型，均顯示比單個(gè)遺傳標(biāo)記有更好的多態(tài)性。同時(shí)，SNP、InDel突變率低（為10-9～10-8）[9]，更為穩(wěn)定。本研究擬選取DNA聯(lián)合索引系統(tǒng)（combined DNA index system，CODIS）中突變率較高的基因座D18S51[10]，與其側(cè)翼區(qū)的3個(gè)SNP位點(diǎn)［rs8089331（C/G）、rs8094489（A/G）、rs7236090（T/C）］，組成SNP-STR單倍型，調(diào)查其在成都漢族人群的分布情況，并應(yīng)用于二聯(lián)體親子鑒定案件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

選取成都地區(qū)75名無(wú)親緣關(guān)系的漢族個(gè)體，在簽署知情同意書(shū)后，抽取肘靜脈血2mL留檢。

1.2 DNA提取

采用鹽析法[11]提取核基因組DNA。

1.3 STR分型

D18S51基因座引物信息來(lái)自STRBase數(shù)據(jù)庫(kù)，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[12]，在9700型PCR儀（美國(guó)AB公司）上進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染，以實(shí)驗(yàn)室自制的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行分型。

1.4 SNP的篩選和分型

在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)查看基因座D18S51側(cè)翼序列信息，選取側(cè)翼區(qū)最小等位基因頻率＞0.1的SNP位點(diǎn)。選擇的3個(gè)SNP位點(diǎn)（rs8089331、rs8094489 和 rs7236090）與 D18S51 的相對(duì)位置如圖1所示。

圖1 D18S51及其側(cè)翼區(qū)3個(gè)SNP的相對(duì)位置

通過(guò)等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)（allele specific polymerase chain reaction，ASPCR）方法[13]獲得 SNP分型。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的SNP位點(diǎn)序列信息，使用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)引物，在正向引物3′端引入錯(cuò)配堿基，通用反向引物為5′-ATTCTACCAGCAACAA CACAAATAAAC-3′，擴(kuò)增采用 LATaq?DNA聚合酶（日本TaKaRa公司），正向引物序列、具體反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件如表1（擴(kuò)增條件均為預(yù)變性95℃ 4min和最后延伸72℃ 10 min，表中略）。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線燈下觀察熒光帶，通過(guò)條帶的有無(wú)進(jìn)行分型。為防止非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的分型錯(cuò)誤，每個(gè)樣品同時(shí)通過(guò)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP） 技術(shù)驗(yàn)證分型結(jié)果。

表1 ASPCR正向引物序列、反應(yīng)體系、擴(kuò)增條件及產(chǎn)物大小

1.5 SNP-STR單倍型分型

參照本課題組報(bào)道的巢式PCR技術(shù)[7]：在ASPCR擴(kuò)增后，選取距STR最遠(yuǎn)的SNP雜合子的PCR產(chǎn)物（如rs8089331為純合子，選擇rs8094489雜合子；如rs8089331和rs8094489為純合子，選擇rs7236090雜合子），稀釋107倍作為擴(kuò)增模板，重復(fù)1.4節(jié)獲得單鏈的SNP單倍型，重復(fù)1.3節(jié)的步驟獲得單鏈的STR分型，拼接后即可獲得SNP-STR單倍型。

如果3個(gè)SNP均為純合子，則直接獲得單倍型。

1.6 單倍型統(tǒng)計(jì)

采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算單倍型的個(gè)數(shù)，根據(jù)NEI[14]的公式計(jì)算單倍型多樣性。

1.7 案例應(yīng)用

案例1：當(dāng)事人懷疑孩子為妻子與自己父親所生，故委托鑒定自己是否為孩子的生物學(xué)父親，采用AmpF?STR?IdentifilerTM試劑盒（美國(guó)AB公司）復(fù)合擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)FGA、D18S51兩個(gè)基因座不符合遺傳規(guī)律，其中被檢父基因型為 FGA（22，24）、D18S51（16，16），孩子為 FGA（23，26）、D18S51（13，17）。

案例2：二聯(lián)體親子鑒定案例，采用AmpF?STR?IdentifilerTM試劑盒復(fù)合擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)D18S51基因座不符合遺傳規(guī)律，被檢父基因型為 D18S51（12，20），孩子為 D18S51（14，18），加做 STRtyper-10G 試劑盒（珠海科登生物技術(shù)有限公司）及本實(shí)驗(yàn)室自制的miniYSTR試劑盒[15]進(jìn)行驗(yàn)證。

兩個(gè)案例均通過(guò)本文描述的方法獲得SNP-STR單倍型，如果孩子可以從被檢父處獲得SNP單倍型，兩步突變PI值[16]的計(jì)算公式為：

公式中STR位點(diǎn)的平均突變率（μ）參照LI等[10]的報(bào)道，D18S51位點(diǎn)的μ值為0.0025。

2 結(jié) 果

通過(guò)本研究建立的方法，成功獲得75名個(gè)體的150個(gè)SNP-STR單倍型。僅檢測(cè)3個(gè)SNP時(shí)，單倍型只有7種，當(dāng)引入STR組成SNP-STR后，單倍型增加到43種。75名個(gè)體的單倍型個(gè)數(shù)分布情況見(jiàn)表2，單倍型多樣性為0.9486。

表2 D18S51基因座與其側(cè)翼區(qū)的3個(gè)SNP組成的SNP-STR單倍型個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)

案例1中，被檢父SNP-STR單倍型為CAC-16、CAC-16，孩子為 GGC-13、GAT-17，被檢父和孩子無(wú)相同的SNP單倍型和STR分型，兩個(gè)SNP和兩個(gè)STR同時(shí)發(fā)生突變的概率極低，排除親權(quán)關(guān)系。

案例2中，被檢父SNP-STR單倍型為CAC-12、CAT-20，孩子為 CAT-14、CAT-18，被檢父和孩子有一個(gè)相同的SNP單倍型CAT。引入SNP-STR后，PI值為0.001339286。聯(lián)合AmpF?STR?IdentifilerTM和STRtyper-10G兩個(gè)試劑盒共24個(gè)STR基因座檢測(cè)結(jié)果，CPI為1 685 160.35，檢測(cè)系統(tǒng)的二聯(lián)體非父排除率大于0.999 999[17]，且6個(gè)Y-STR基因座分型結(jié)果均符合父系遺傳規(guī)律，支持父權(quán)關(guān)系的存在。

3 討 論

STR基因座，特別是CODIS的13個(gè)STR基因座，包含在很多商品化試劑盒中，已做了大量的群體多態(tài)性調(diào)查，建立了相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)，為個(gè)體識(shí)別和親子鑒定提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。在現(xiàn)有的STR數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，引入SNP單倍型“尾巴”，組成SNP-STR，可以提高遺傳標(biāo)記的信息量。但應(yīng)注意選擇的SNP應(yīng)和STR在同一個(gè)單倍型區(qū)塊，不能橫跨突變熱點(diǎn)。單倍型一般通過(guò)系譜推斷、統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算或者實(shí)驗(yàn)法獲得，對(duì)于單個(gè)個(gè)體的單倍型，只能通過(guò)實(shí)驗(yàn)法[18]。本研究是通過(guò)ASPCR方法獲取單拷貝片段，再對(duì)單拷貝片段的遺傳標(biāo)記進(jìn)行分型，最后將分型結(jié)果順序排列組成單倍型。但是，ASPCR方法會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果，可以通過(guò)升高退火溫度、降低Mg2+濃度、減少循環(huán)次數(shù)等方法提高PCR反應(yīng)的特異性。同時(shí)，本研究還通過(guò)RFLP方法來(lái)確保SNP分型的正確性。但是，整個(gè)方法過(guò)于繁瑣，且本次研究樣品量偏少，在下一步的研究中會(huì)增加樣本量。隨著三代測(cè)序平臺(tái)的出現(xiàn)，例如單分子熒光或納米孔[19]，可以簡(jiǎn)化獲得常染色體單倍型的過(guò)程，在未來(lái)可能成為高通量且能得到較長(zhǎng)單倍型片段的主流方法。

在成都漢族人群中，CAT、CAC是兩種主要的SNP單倍型，在150個(gè)單倍型中占了73.3%。對(duì)于不同的D18S51等位基因，其尾隨的SNP單倍型分布也各不一樣：等位基因?yàn)?3、14時(shí)，CAT占多數(shù)；等位基因?yàn)?5、16時(shí)，CAC 占多數(shù)。

單倍型區(qū)塊中SNP個(gè)數(shù)越多，單倍型種類(lèi)越多，CSF1PO側(cè)翼區(qū)的5個(gè)SNP共發(fā)現(xiàn)了26種單倍型[7]。由于SNP突變率極低，多個(gè)SNP同時(shí)突變的情況接近于零。因此，案例1中孩子的SNP單倍型無(wú)法從被檢父處找到來(lái)源，可以排除被檢父為其生物學(xué)父親的可能。如果能找到SNP單倍型來(lái)源，可以直接觀察孩子的STR突變來(lái)自父親的哪一條染色體。案件2中被檢父和孩子有一個(gè)相同的SNP單倍型CAT，所以孩子D18S51等位基因18是由被檢父的等位基因20滑脫了2個(gè)核心序列后產(chǎn)生。將SNP-STR引入PI的計(jì)算，簡(jiǎn)化了公式，同時(shí)降低了誤判的可能性，較STR可能會(huì)有更高的PI值，使CPI達(dá)到認(rèn)定親權(quán)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)[7]。

相對(duì)于STR，SNP-STR能以較少的數(shù)量達(dá)到STR同樣的效能，而且可以在復(fù)雜親緣關(guān)系鑒定中發(fā)揮重要的作用，應(yīng)引起法醫(yī)學(xué)者的重視。

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