陳海琳，周永明，陸?zhàn)?，孫偉玲，王怡超，吳志豪，李昌桂，徐靜

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437)

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)是一組起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，以無效造血和高風(fēng)險向急性白血病轉(zhuǎn)化為特征，表現(xiàn)為形態(tài)上病態(tài)造血和外周血血細(xì)胞減少[1]。臨床上以單系或多系血細(xì)胞減少為主要表現(xiàn)[2]。MDS發(fā)病機(jī)制至今仍不明確。

自噬(autophagy)是一種高度保守的經(jīng)溶酶體介導(dǎo)的對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器進(jìn)行降解、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境自身穩(wěn)定的過程，是細(xì)胞面臨營養(yǎng)缺乏或應(yīng)激狀態(tài)時的自我保護(hù)機(jī)制[3]。自噬參與生物過程的各個方面，包括細(xì)胞存活、死亡、增殖、分化、衰老和癌變[4-5]。 近年來的一些研究表明，自噬異常與MDS發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，自噬可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的形成、增殖、能量代謝等諸多方面。通過調(diào)節(jié)自噬失衡有可能成為治療MDS的新思路?，F(xiàn)就目前MDS中自噬及相關(guān)中醫(yī)藥研究作一介紹。

1 自噬的功能、分類及過程

自噬的生理功能主要是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及維持細(xì)胞存活。依據(jù)自噬過程中底物進(jìn)入溶酶體的途徑，可以被分為三類：巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)自噬(chaperone-mediated autophagy CAM)[6]。巨自噬即是通常意義的自噬，是自噬最常見的類型，本文中的自噬均指巨自噬。自噬過程主要包括：起始、延伸、成熟、自噬體與溶酶體融合和降解等步驟[7]。自噬是一種起始于稱為PAS(pre-autophagosomal structure, 自噬體前結(jié)構(gòu))的泡狀過程[8]。PAS首先在釀酒酵母中被鑒定，并被認(rèn)為是吞噬泡(phagophore)的前體。但尚未確定PAS是否存在于哺乳動物細(xì)胞中。吞噬泡或隔離膜募集、容納所有誘導(dǎo)自噬所需的Atg(自噬相關(guān))蛋白。吞噬泡擴(kuò)大并隔離胞質(zhì)成分，最終成為雙膜囊泡，即自噬體。自噬體與內(nèi)涵體融合形成自噬性液泡(amphisome)，然后其與晚期內(nèi)涵體和溶酶體融合成為自溶酶體(autolysosome)。自溶酶體與晚期內(nèi)涵體和溶酶體的直接融合也可能發(fā)生。這個過程導(dǎo)致隔離內(nèi)容物的降解，降解產(chǎn)物可以被細(xì)胞重新利用[9]。

在哺乳動物中，HSC(造血干細(xì)胞)衍生的早期祖細(xì)胞成熟為紅細(xì)胞，主要在BM(骨髓)中從幼紅細(xì)胞開始，去核后成為網(wǎng)織紅細(xì)胞。新形成的網(wǎng)織紅細(xì)胞在外周循環(huán)中進(jìn)一步發(fā)育成紅細(xì)胞，在紅細(xì)胞中完成蛋白質(zhì)合成，獲得雙凹形狀并去除所有剩余的細(xì)胞器，主要是線粒體。線粒體自噬對這種發(fā)育調(diào)節(jié)性線粒體降解至關(guān)重要[10]。這個過程開始于一個主要來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體和高爾基體的特殊膜的延伸，稱為吞噬泡。吞噬泡圍繞需被消除的分子和細(xì)胞器，當(dāng)兩個膜端連接時，形成稱為自噬體的囊泡。這種細(xì)胞器與胞內(nèi)結(jié)構(gòu)相互作用，產(chǎn)生一種前溶酶體雜交細(xì)胞器，稱為amphisome。最后，amphisome與溶酶體融合，導(dǎo)致酶蛋白水解,使被隔離的物質(zhì)降解[11]。

2 自噬相關(guān)信號調(diào)控

自噬以自噬小體形成為核心，受Atg基因以及多種信號途徑傳導(dǎo)的調(diào)控。對酵母和哺乳動物的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有40個Atg基因，其編碼的蛋白質(zhì)參與自噬[12-13]。自噬誘導(dǎo)階段哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)參與調(diào)控。mTOR可以感受生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞能量狀態(tài)和應(yīng)激反應(yīng)。正常狀況下，mTOR可以抑制細(xì)胞自噬的活化。當(dāng)出現(xiàn)饑餓、營養(yǎng)匱乏以及壓力刺激等狀態(tài)時，mTOR則通過mTOR/Atg1/Atg13信號通路以及mTOR/ULK1/Atg13信號通路影響自噬[14]。典型的自噬涉及外源性或內(nèi)源性刺激使線粒體去極化同時產(chǎn)生活性氧(ROS)。進(jìn)而通過活化AMP激活的蛋白激酶(AMPK)信號通路，抑制mTOR。這一過程激活典型的自噬蛋白如ULK1和Beclin-1，導(dǎo)致膜的成型和吞噬泡形成。ULK和Beclin1-PI3KC3復(fù)合物是自噬體形成所需的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物。mTORC1和AMPK直接向ULK復(fù)合物發(fā)出信號并影響其活動。不同Beclin1-PI3KC3復(fù)合物的形成和活化產(chǎn)生磷脂酰肌醇3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P)，這是募集自噬效應(yīng)物所需的信號傳導(dǎo)脂質(zhì)。另一方面，在涉及Atg7和Atg5等的酶促過程中，通過磷脂酰乙醇胺脂化形成LC3-II使自噬相關(guān)蛋白LC3的構(gòu)象變化，實現(xiàn)LC3的活化。而LC3-II錨定在吞噬泡膜上。去極化或受損的線粒體將蛋白暴露在其表面具有能與LC3相互作用的區(qū)域(LIR)。這使得當(dāng)自噬體完全形成時，LC3和吞噬泡相互作用，圍住并吞噬受損細(xì)胞器。帶有吞噬物的自噬體繼續(xù)其成熟過程，最終與溶酶體融合降解內(nèi)含物[11,9]。

3 自噬與凋亡

自噬和凋亡之間也有千絲萬縷的關(guān)系。自噬與凋亡之間調(diào)控原件的相互作用證明這兩個過程交叉的復(fù)雜性，例如Bcl-2與Beclin-1的相互作用，LC3B與Fas的相互作用等[15]。雖然沒有證明過度自噬與自噬抑制直接引起細(xì)胞死亡，但也有學(xué)者認(rèn)為兩者可能都與凋亡相關(guān)[16]。有報道認(rèn)為，自噬是凋亡發(fā)生所必需的，通常發(fā)生在凋亡之前，進(jìn)而啟動凋亡。自噬的發(fā)生也可以抑制凋亡，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞。細(xì)胞自噬可以通過自噬相關(guān)蛋白降解促凋亡蛋白，如Caspase、B cell lymphoma2(Bcl-2)家族蛋白等，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。自噬與凋亡之間可以發(fā)生轉(zhuǎn)化，一些環(huán)境中，當(dāng)?shù)蛲霰灰种茣r，細(xì)胞就會向自噬轉(zhuǎn)化[17]。

4 自噬與MDS

4.1 MDS的自噬異?，F(xiàn)象

自噬在腫瘤細(xì)胞中通常處于異?；蚴д{(diào)狀態(tài)[18]。MDS為血液系統(tǒng)惡性腫瘤性疾病，也發(fā)現(xiàn)存在自噬失常。異質(zhì)性較高的MDS中，患者的自然病程和預(yù)后的差異性很大，自噬在不同亞型MDS中，其失衡的不同狀況值得關(guān)注。目前國內(nèi)外研究主要結(jié)合IPSS、WPSS預(yù)后分組系統(tǒng)將MDS分為兩組：相對低危組(IPSS-低危組、中危-1組，IPSS-R-極低危組、低危組和中危組，WPSS-極低危組、低危組和中危組)和相對高危組(IPSS-中危-2組、高危組，IPSS-R-中危組、高危組和極高危組，WPSS-高危組和極高危組)。結(jié)果低危組MDS患者外周血血小板的減少是由于骨髓巨核細(xì)胞中存在過度自噬等細(xì)胞程序性死亡造成的[19]。與正常健康人對照，低危組MDS紅系集落中可見早期紅系分化中存在過度自噬現(xiàn)象[20]。動物實驗也證實了相同的觀點(diǎn)，條件性敲除小鼠造血干細(xì)胞必要的自噬基因Atg7，當(dāng)大量Atg7-/-紅細(xì)胞積累導(dǎo)線粒體膜電位的改變和細(xì)胞死亡[21]，則小鼠發(fā)展成貧血，表現(xiàn)類似MDS。

另一方面，有研究提示相對高危組MDS患者自噬水平明顯減低，有核紅細(xì)胞自噬水平隨危險度的升高而降低[22]。也有非直接的證據(jù)表明，自噬與急性髓細(xì)胞白血病發(fā)病有關(guān)，在AML患者中可見PI3K/AKT/mTOR信號通路活化異常[23]。在白血病細(xì)胞中，自噬可能是有害的，可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率增加或者對癌細(xì)胞的增殖和存活起到保護(hù)作用[10]。MDS發(fā)展向白血病轉(zhuǎn)化過程中也可能存在自噬異常，但上述報道較少，是國內(nèi)外研究的薄弱環(huán)節(jié)。

4.2 自噬失調(diào)為MDS發(fā)生及進(jìn)展病理機(jī)制之一

自噬失調(diào)存在于MDS中的證據(jù)越來越明確。MDS發(fā)病與細(xì)胞分化異常，基因組不穩(wěn)定等相關(guān)[24]，進(jìn)而引起造血細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失常。而細(xì)胞自噬正是維持體內(nèi)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，同時參與紅系、血小板等多系造血細(xì)胞分化[25]。機(jī)體正常的細(xì)胞都具有自噬能力，這一能力可以為細(xì)胞清除化學(xué)致癌物以及因射線、氧化應(yīng)激而受損的細(xì)胞器(主要是線粒體)，從而使細(xì)胞DNA避免因活性氧物質(zhì)(ROS)而造成損傷，保證了遺傳穩(wěn)定性，降低了細(xì)胞惡變的發(fā)生率。所以自噬在維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要的作用[26]。研究表明，自噬基因Atg7缺乏的小鼠其造血干細(xì)胞(HSCs)自我修復(fù)能力受損，MDS患者中可見自噬缺乏的造血干/祖細(xì)胞線粒體受損、并與ROS增高及細(xì)胞增殖與凋亡水平的增加相一致[3]。同時自噬與MDS免疫穩(wěn)態(tài)也密切相關(guān)，自噬對T細(xì)胞陽性、陰性選擇、B1a細(xì)胞發(fā)展、記憶性B細(xì)胞及漿細(xì)胞的維護(hù)保持、IgG分泌平衡等發(fā)揮著重要的作用。若自噬缺乏則會導(dǎo)致免疫穩(wěn)態(tài)失衡，細(xì)胞對各種壓力更加敏感，最終導(dǎo)致如MDS等惡性血液腫瘤疾病的發(fā)生[27]。

4.3 MDS治療與自噬調(diào)節(jié)

實體腫瘤疾病中，自噬已被證明可以抑制腫瘤發(fā)展，并可以激活細(xì)胞程序性死亡。但另一方面由于自噬可以為癌細(xì)胞提供能量，當(dāng)細(xì)胞處于營養(yǎng)匱乏、ATP及氧化應(yīng)激等不利條件時，則激活自噬，將促進(jìn)腫瘤增殖[28]。自噬在MDS發(fā)病發(fā)展過程中是把“雙刃劍”,具有雙向調(diào)節(jié)的作用。因此，調(diào)節(jié)自噬失調(diào)成為MDS治療的熱點(diǎn)之一[25]。有研究表明，mTOR抑制劑替西羅莫司治療2周SF3B1+/-小鼠表現(xiàn)出血紅蛋白的提升[29]。自噬抑制劑氯喹(chloroquine CQ)也被報道可以提高阿扎胞苷(5-azacytidine)細(xì)胞毒作用，提高治療療效，為阿扎胞苷治療后病情仍進(jìn)展的MDS患者提供了全新的治療方法[30]。

5 中醫(yī)藥治療MDS的自噬調(diào)節(jié)研究

5.1 自噬的中醫(yī)內(nèi)涵

自噬是真核細(xì)胞特有的保護(hù)機(jī)制，其主要作用在于維持細(xì)胞穩(wěn)定性，提高細(xì)胞對外界如饑餓、壓力等應(yīng)激狀況下的適應(yīng)能力，清除異常代謝的成分，以對抗外界不利因素，其雙向調(diào)節(jié)保持生理平衡的功能，與中醫(yī)扶正祛邪理論實質(zhì)緊密相關(guān)。石冬燕等[31]認(rèn)為，自噬與中醫(yī)衛(wèi)氣密切相關(guān)。邪氣入侵機(jī)體后正氣奮起抗邪，祛邪外出與自噬清除“垃圾”產(chǎn)物并保護(hù)受損細(xì)胞的機(jī)制某種程度極其一致。王玉等[32]則認(rèn)為，自噬的發(fā)生與中醫(yī)痰瘀機(jī)制存在相似之處。細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)的形成是中醫(yī)“痰瘀”形成的微觀原因，細(xì)胞自噬對有害物質(zhì)進(jìn)行降解和清除過程則是中醫(yī)“煉精化氣”的微觀體現(xiàn)。

中醫(yī)理論認(rèn)為，氣具有推動，溫煦、防御、固攝、營養(yǎng)、氣化等功能。細(xì)胞自噬與上述功能密切相關(guān)。通過調(diào)節(jié)自噬功能，推動、促進(jìn)、激發(fā)人體的生長發(fā)育及維持臟腑經(jīng)絡(luò)等器官的生理功能；當(dāng)自噬功能減退時，氣的推動功能減弱，可出現(xiàn)病理產(chǎn)物堆積過多，衰老、機(jī)體運(yùn)行遲緩等異常。氣之溫煦作用通過促進(jìn)機(jī)體新陳代謝來實現(xiàn)，自噬正是機(jī)體細(xì)胞新陳代謝的主要方式之一。氣的固攝作用通過氣對血、津液等物質(zhì)的穩(wěn)定來實現(xiàn)，自噬的主要功能即是維持穩(wěn)態(tài)。氣的營養(yǎng)作用表現(xiàn)為細(xì)胞自噬通過自身凈化、轉(zhuǎn)化，自我營養(yǎng)的過程。氣化泛指內(nèi)外環(huán)境、人體物質(zhì)基礎(chǔ)的互相轉(zhuǎn)化，也提示了細(xì)胞自噬作用傳化的特點(diǎn)。因此筆者認(rèn)為，細(xì)胞自噬功能與中醫(yī)正氣功能的實質(zhì)內(nèi)涵相關(guān)，符合“氣有勝復(fù)，勝復(fù)之作，有德有化，有用有變”的特征。而“痰”“濕”“瘀”“毒”則是微觀自噬功能失調(diào)，宏觀呈現(xiàn)正氣不足，內(nèi)生實邪的病理表現(xiàn)。

5.2 中醫(yī)藥調(diào)節(jié)自噬研究進(jìn)展及調(diào)節(jié)自噬治療MDS的可行性

古籍中醫(yī)文獻(xiàn)并無骨髓增生異常綜合征病名，根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)，可將MDS歸屬于“虛勞”“血證”“內(nèi)傷發(fā)熱”等證范疇。目前臨床骨髓增生異常綜合征通常對應(yīng)的中醫(yī)病名為“髓毒勞”，其含義為：“髓”代表病位，“毒”代表病性,“勞”代表病狀[33]。雖然中醫(yī)臨床各家對MDS病因病機(jī)各有不同表述，莫衷一是，但均認(rèn)可其病性為正虛邪實，兩者并存。但隨著MDS疾病發(fā)展，正消邪長，先是表現(xiàn)出正虛為主、邪實為輔，繼而正邪抗衡，直至轉(zhuǎn)變?yōu)樾皩崬橹?、正虛為輔等正邪虛實偏重不同[34]。中藥治療MDS則常結(jié)合分期分型實施辨證論治。MDS低危期主要以扶正為主兼以清解邪毒；而高危期則重用解毒化瘀，佐以健脾補(bǔ)腎，益氣養(yǎng)陰之品[35]。

MDS的正邪轉(zhuǎn)化與自噬失調(diào)密切相關(guān)，因此，對MDS具有良好作用的中醫(yī)藥干預(yù)自噬失常研究及應(yīng)用擁有廣闊前景。近年越來越多的研究表明，治療MDS使用頻次較高的健脾補(bǔ)腎、益氣養(yǎng)陰、解毒化瘀類中藥對自噬具有良好的調(diào)節(jié)作用。如具有扶正之功的黨參、白術(shù)、莪術(shù)、半夏等組成的中藥顆粒，體內(nèi)研究顯示，每天1次維持25天可顯著減少腫瘤體積約50%，可以誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞自噬的模式，包括細(xì)胞內(nèi)空泡形成，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)轉(zhuǎn)換。Hoechst 33258染色和凋亡相關(guān)蛋白的Western印跡分析顯示其誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞死亡不是通過細(xì)胞凋亡，而是通過自噬作用誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞死亡[36]。以全蝎、蜈蚣、地龍、陳皮、半夏、白術(shù)、水蛭為主方的搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方可以增加自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3蛋白的表達(dá)，提高自噬作用保護(hù)細(xì)胞抵御各種應(yīng)激，防止細(xì)胞發(fā)生凋亡及壞死[37]。靛玉紅衍生物(E804)作為中藥靛玉紅的一種有效成分可抑制腫瘤細(xì)胞活性，促進(jìn)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-B及Beclin-1的表達(dá)上升，且呈明顯的劑量依賴效應(yīng)。其作用機(jī)制涉及通過抑制Stat3 (signal transducerand activator oftranscription 3) 活化促進(jìn)胃癌細(xì)胞自噬活動來抑制胃癌細(xì)胞生長[38]。人參皂苷Rh2(Rh2)能通過激活MAPK、ATK、EKR信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬途徑，從而抑制人白血病細(xì)胞KG1α細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡[39]。青蒿琥酯(artesunate，ART)是從黃花蒿莖葉中提取的有效成分。研究表明ART以時間劑量依賴性方式抑制白血病K562細(xì)胞自噬，可能通過抑制自噬體的融合降解、下調(diào)自噬形成相關(guān)分子HMGB1、Beclin-1的表達(dá)而減弱腫瘤細(xì)胞對惡劣腫瘤微環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)，擴(kuò)大腫瘤細(xì)胞的損傷，最終促進(jìn)K562細(xì)胞的死亡[40]。綜上，現(xiàn)有研究揭示中藥可參與自噬調(diào)節(jié)，自噬穩(wěn)態(tài)的調(diào)控而發(fā)揮治療作用，這可能與其正氣充養(yǎng)調(diào)節(jié)，痰、瘀、毒等病理產(chǎn)物的清除有關(guān)。因此通過干預(yù)糾正自噬異常也可能是中藥治療MDS一條有效途徑。

6 結(jié)語

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)揭示,MDS的發(fā)生和發(fā)展是多步驟，多環(huán)節(jié)的漸進(jìn)過程，細(xì)胞自噬途徑可能參與MDS發(fā)生發(fā)展，并且在不同階段及病情狀態(tài)下，自噬失衡存在動態(tài)變化，造成MDS外周血細(xì)胞不同程度的減少，產(chǎn)生貧血、感染、出血等臨床癥狀，甚至自噬失衡參與骨髓增生異常綜合征向白血病傳化的病理機(jī)制。中醫(yī)藥研究發(fā)現(xiàn),MDS具有“本虛標(biāo)實、正消邪長”的病證特性，中醫(yī)藥辨證治療MDS顯現(xiàn)臨床療效，同時不少臨床常用治療MDS有效中藥復(fù)方、單藥及中藥成分對自噬存在調(diào)節(jié)作用，這些為臨床的治療選擇提供了新的思路及研究方向。但細(xì)胞自噬異常與MDS疾病發(fā)生發(fā)展的深入研究報道至今仍然較少，自噬在各類型MDS中的具體表現(xiàn)、失衡機(jī)制及亞組間比較分析的相關(guān)報道也較少，細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及細(xì)胞自噬起源仍不十分清楚。尤其2016年WHO根據(jù)形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等對MDS進(jìn)行了新的分型[1]，精準(zhǔn)醫(yī)療及分層治療在MDS治療策略中日益受到重視，這些都值得我們深入研究。與此同時，中醫(yī)藥對于自噬干預(yù)的研究雖有報道，但針對MDS不同分期分型所呈現(xiàn)的不同自噬失常狀態(tài)，實施中藥或中藥復(fù)方精準(zhǔn)干預(yù)的研究仍為空白，值得引起關(guān)注。期望盡快開展相關(guān)研究，為臨床中醫(yī)藥治療MDS提供新的有效方案和明確的作用機(jī)制。