彭芳，鐘斌，王建，張功亮，楊人澤

(1、贛州市人民醫(yī)院病理科，江西贛州341000；2、贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，江西贛州341000)

ING4在結(jié)腸和直腸的胃腸間質(zhì)瘤表達(dá)的研究

彭芳1，鐘斌2，王建1，張功亮1，楊人澤2

(1、贛州市人民醫(yī)院病理科，江西贛州341000；2、贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，江西贛州341000)

目的研究ING4與結(jié)腸和直腸的胃腸間質(zhì)瘤的惡性程度的關(guān)系。方法收集原發(fā)于結(jié)腸和直腸的胃腸間質(zhì)瘤共62例，并用RT-PCR方法和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)ING4 mRNA和ING4蛋白在胃腸道間質(zhì)瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中的表達(dá)情況。結(jié)果RT-PCR技術(shù)測(cè)定胃腸道間質(zhì)瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4與β-actin光密度比值平均值分別為0.32、0.51、0.56和0.78胃腸道間質(zhì)瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4 mRNA的量也依次增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。62例ING4免疫組織化學(xué)結(jié)果：高危組陽(yáng)性3例（陽(yáng)性率18.8%）；中危組陽(yáng)性6例（陽(yáng)性率26.1%）；低危組陽(yáng)性10例（陽(yáng)性率55.6%）；極低危組陽(yáng)性3例（陽(yáng)性率60%）。胃腸道間質(zhì)瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4蛋白表達(dá)陽(yáng)性率也依次增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論ING4可以作為一個(gè)新的評(píng)價(jià)胃腸道間質(zhì)腫瘤惡性程度的指標(biāo)。

ING4；胃腸間質(zhì)瘤；RT-PCR；免疫組織化學(xué)

ING4基因是Shiseki M等[1]于2003年發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因，它參與調(diào)節(jié)P53活性、腫瘤血管的增生、細(xì)胞對(duì)缺氧狀態(tài)的適應(yīng)、細(xì)胞接觸抑制的丟失以及細(xì)胞對(duì)化學(xué)藥物敏感性等影響腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)及對(duì)腫瘤治療的多個(gè)方面[1-6]。胃腸間質(zhì)瘤是胃腸道常見的間葉源性腫瘤，可發(fā)生于胃腸道的任何部位，這種腫瘤起源于間質(zhì)的起搏細(xì)胞（Cajal細(xì)胞）[7]，這些起搏細(xì)胞穿插在腸壁平滑肌組織和自主神經(jīng)系統(tǒng)之間[4，8]。本實(shí)驗(yàn)在基因水平和蛋白水平探討ING4與結(jié)腸和直腸的胃腸間質(zhì)瘤的惡性程度的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集我院2005年至2016年10月間原發(fā)于結(jié)腸和直腸的胃腸間質(zhì)瘤共62例。男性38例，女性24例，年齡31～79歲，平均年齡55歲。51例腫瘤位于結(jié)腸，11例腫瘤位于直腸。41例患者表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作腹痛，查體發(fā)現(xiàn)腹部包塊，9例患者以消化道出血為首發(fā)癥狀就診，4例以腫瘤破裂合并急腹癥，8例患者體檢發(fā)現(xiàn)腫塊入院。腫瘤最大徑0.5～12cm，平均最大徑4cm。56例腫瘤邊界尚清楚，6例腫瘤破裂。其中黏膜下3例，肌壁間32例，漿膜外27例。腫物切面實(shí)性，灰紅色灰白色，部分區(qū)域呈魚肉狀，質(zhì)中偏嫩，灶性區(qū)域囊性變伴出血壞死。根據(jù)腫瘤大小、核分裂像和有無(wú)腫瘤性壞死分為高危組、中危組、低危組和極低危組，其中高危組16例，中危組23例，低危組18例，極低危組5例。

1．2實(shí)驗(yàn)材料ING4和β-actin引物購(gòu)自天為時(shí)代科技（北京）有限公司，2×Taq PCR MasterMix購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，Trizol和Prime ScriptTMRT reagent kit購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。一抗兔抗人ING4多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcom公司，兔鼠通用型免疫組化SP法檢測(cè)試劑盒及DAB顯色劑均購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RT－PCR方法總RNA提?。喝〖s200mg組織，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol勻漿。震蕩30s。加0.2ml氯仿，劇烈地?fù)u動(dòng)30s，靜置3min。12000×g，4℃離心，15min。吸出上層無(wú)色水相，移入另一個(gè)EP管中（約0.5ml）。加入等體積的異丙醇，混勻，靜置10min。12000×g，4℃離心，10min。在管底部可見微量RNA的沉淀，棄去上清，加75%乙醇1ml，振蕩。7500×g，4℃離心，10min。棄去上清，用濾紙吸取殘留液體，室溫下干燥5～10min。沉淀溶于20μl DEPC水中，-70℃保存。

1.3.2 計(jì)算總RNA提取樣品的純度與質(zhì)量所有標(biāo)本的OD260nm/OD280nm值均在1.8～2.0之間，表明總RNA純度較高，沒有蛋白質(zhì)殘留?？俁NA變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：18S和28S的條帶清晰，隱約可見5S。提示RNA提取完整，無(wú)降解。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA用Prime ScriptTMRT reagent kit，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

在0.1%DEPC處理的EP管中依次加入以下試劑：

5×PrimeScript Buffer2μl

PrimeScript RT Enzyme MIX I0.5μl

Oligo dT Primer0.5μl

Random 6mers0.5μl

Total RNA4μl

Rnase Free dH2O2.5μl

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃水浴15min（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），后置于85℃5sec（使反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）。置于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）ING4基因檢測(cè)引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度和PCR反應(yīng)條件，以β-actin作為對(duì)照。見表1、表2。

PCR反應(yīng)體系

10×Buffer(15mM MgCl2)5.0μl

dNTP(2.0mM)4.0μl

上、下游引物各1.0μl

Taq酶0.5μl

模板(cDNA)5.0μl

用無(wú)核酶水定容至25.0μl

加無(wú)菌石蠟油25.0μl

表1 PCR引物序列

表2 PCR反應(yīng)條件

1.3.5 瓊脂糖凝膠電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl點(diǎn)樣，2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色顯示，在透射紫外光分析儀下攝影，并用激光光密度圖象掃描儀掃描。

1.3.6 凝膠分析定量計(jì)算方法為：所得ING4擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶與β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶的綜合灰度之比代表mRNA的表達(dá)水平。

1.3.7 質(zhì)量控制設(shè)立了空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和內(nèi)對(duì)照組?？瞻讓?duì)照：用DEPC水替代cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。陰性對(duì)照組：以RNA替代cDNA用于PCR擴(kuò)增。內(nèi)對(duì)照組：以β-actin引物，擴(kuò)增的cDNA，證實(shí)提取的RNA產(chǎn)物是否可以用于擴(kuò)增目的DNA。

1.3.8 免疫組織化學(xué)方法免疫組織化學(xué)試劑一抗采用英國(guó)Abcom公司生產(chǎn)的ING4多克隆抗體。檢測(cè)系統(tǒng)也采用福建邁新公司的Elivision試劑盒。石蠟切片厚度3μm，60℃烤箱烤片1h，梯度二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水浸泡5min，3%過氧化氫室溫孵育10min阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性，PBS液沖洗，高壓鍋抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫。加入二步法Elivision試劑盒中試劑A，室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次5min，加入試劑盒中試劑B，室溫下孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min。鏡下控制DAB顯色，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，脫水，透明，中性樹膠封片，每次均做陽(yáng)性對(duì)照及PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

1.3.9 免疫細(xì)胞化學(xué)判斷的標(biāo)準(zhǔn)定位準(zhǔn)確，呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性，ING4陽(yáng)性定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性細(xì)胞小于10%為（-），11%～25%為（+），26%～50%為（++），51%～75%為（+++），76%～100%為（++++）

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法RT-PCR實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，RTPCR實(shí)驗(yàn)的圖片用Image tool軟件進(jìn)行灰度值分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR方法檢測(cè)胃腸道間質(zhì)瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4mRNA的表達(dá)情況RT-PCR技術(shù)測(cè)定胃腸道間質(zhì)瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4mRNA表達(dá)情況（見圖1）。各組中ING4與β-actin光密度比值平均值分別為0.32、0.51、0.56和0.78（見表3）。胃腸道間質(zhì)瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4mRNA的量也依次增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 胃腸道間質(zhì)瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4 mRNA表達(dá)情況（x±s）

圖1 胃腸道間質(zhì)瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4 mRNA表達(dá)情況

2.2 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胃腸道間質(zhì)瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4蛋白的表達(dá)情況62例ING4免疫組織化學(xué)結(jié)果(見圖2)：高危組陽(yáng)性3例（陽(yáng)性率18.8%）；中危組陽(yáng)性6例（陽(yáng)性率26.1%）；低危組陽(yáng)性10例（陽(yáng)性率55.6%）；極低危組陽(yáng)性3例（陽(yáng)性率60%）。胃腸道間質(zhì)瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING蛋白表達(dá)陽(yáng)性率也依次增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

ING4是2003年新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因[1-3]。它參與調(diào)節(jié)P53活性、腫瘤血管的增生、細(xì)胞對(duì)缺氧狀態(tài)的適應(yīng)、細(xì)胞接觸抑制的丟失以及細(xì)胞對(duì)化學(xué)藥物敏感性等影響腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)及對(duì)腫瘤治療的多個(gè)方面[4-12]。ING4蛋白和p53形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而激活p53基因，介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)和修復(fù)；HIF的異常表達(dá)或者激活后通過促進(jìn)血管形成、糖酵解、細(xì)胞增生和分裂等過程促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，ING4直接和HIF的羥化，而抑制腫瘤生長(zhǎng)[13，14]；過度表達(dá)ING4可以顯著負(fù)性調(diào)節(jié)處于G2M停止期細(xì)胞，而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12-15]。

圖2 ING4免疫組織化學(xué)結(jié)果（×200）

本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法和免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)ING4 mRNA和ING4蛋白在胃腸道間質(zhì)瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)胃腸道間質(zhì)瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4 mRNA和ING4蛋白表達(dá)陽(yáng)性率也依次增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

胃腸道間質(zhì)瘤目前評(píng)價(jià)惡性程度主要是依據(jù)腫瘤部位、大小、核分裂像和有無(wú)腫瘤性壞死，而缺乏免疫組織化學(xué)指標(biāo)的支持，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)隨著胃腸道間質(zhì)瘤惡性程度的增加，ING4 mRNA和ING4蛋白的表達(dá)降低。ING4可以作為一個(gè)新的評(píng)價(jià)胃腸道間質(zhì)腫瘤惡性程度的指標(biāo)。

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R735.3，R446.62

A

1674-1129(2017)03-0337-03

2016-12-26；

2017-05-01)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.013

江西省衛(wèi)計(jì)委資助課題，編號(hào)：20167204

彭芳，女，1985年生，主治醫(yī)師，病理與病理生理學(xué)專業(yè)，碩士研究生。

楊人澤，男，1975年生，主任藥師，碩士學(xué)位。研究方向?yàn)獒t(yī)院藥學(xué)和臨床藥學(xué)。