鐘展華，孫愛(ài)農(nóng)

(1、惠州市中心血站，廣東惠州516000；2、中山市中心血站，廣東中山528403)

梯型板和全自動(dòng)加樣儀在疑難配血中的應(yīng)用

鐘展華1，孫愛(ài)農(nóng)2

(1、惠州市中心血站，廣東惠州516000；2、中山市中心血站，廣東中山528403)

目的建立一種應(yīng)用于采供血機(jī)構(gòu)的快速篩選除ABO血型以外特定紅細(xì)胞抗原血源的方法。方法血站檢驗(yàn)科在日常做ABO血型檢測(cè)時(shí)，將稀釋紅細(xì)胞的生理鹽水改為紅細(xì)胞保養(yǎng)液，檢測(cè)后將稀釋板標(biāo)示后保存，編寫智能化全自動(dòng)加樣程序，利用全自動(dòng)加樣器將混合的血型抗體液和供者的紅細(xì)胞加入Olympus梯形板，篩選出相同血型抗原陰性供者。結(jié)果梯形板聯(lián)合全自動(dòng)加樣器的方法和傳統(tǒng)的試管法均能全部篩選出相同血型抗原陰性供者，但梯形板聯(lián)合全自動(dòng)加樣器法所需時(shí)間大大低于傳統(tǒng)的試管法。結(jié)論梯形板和自動(dòng)加樣器的聯(lián)合應(yīng)用，為特殊患者篩選合適血源，具有快速、準(zhǔn)確和低成本的效果，適合在采供血系統(tǒng)推廣。

Olympus梯形板；血源篩選；全自動(dòng)加樣器；疑難配血

不規(guī)則抗體一般指ABO血型系統(tǒng)以外的其他血型系統(tǒng)抗體，主要經(jīng)輸血或妊娠等免疫產(chǎn)生，不規(guī)則抗體會(huì)導(dǎo)致輸血反應(yīng)；輕者引起寒戰(zhàn)、發(fā)熱，影響治療效果；重者破壞輸入的不配合的紅細(xì)胞或縮短其壽命，產(chǎn)生溶血性輸血反應(yīng)，危及病人生命；根據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，最易產(chǎn)生血型不規(guī)則抗體的為Rh血型系統(tǒng)，MNS血型系和kidd血型系統(tǒng)[1，2]，對(duì)于有不規(guī)則抗體或者含溫自身抗體且難于鑒定抗體類型的患者，上述血型系統(tǒng)表型相同的輸血可以避免溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生，為此我們建立一種用Olympus梯型板和全自動(dòng)加樣器智能化技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的方法，可以為此類特殊的受血者從血站的血庫(kù)中快速篩選出相合血液，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要硬件STAR全自動(dòng)加樣器，瑞士Hamilton公司生產(chǎn)，配套英文控制軟件版本為4.30；恒溫振蕩器(上海微百科技公司)；CT6D平板離心機(jī)(日本日立公司)；DK-600S三用水浴箱(廣東環(huán)凱科技公司)；KA-2200離心機(jī)(日本久保田公司)；anthos ht3酶標(biāo)儀(奧地利anthos公司)；10～100μl、20～200μl可調(diào)量程微量移液器(美國(guó)熱電公司)；120孔梯形微孔板，由日本奧林巴斯公司生產(chǎn)；96孔普通微量塑料平底板。

1.2 主要試劑單克隆IgM的抗-D、抗-E、抗-e、抗-C、抗-c試劑均由上海血液生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)；單克隆IgM的抗M，N，S，s Jka，Jkb試劑由加拿大Dominion公司生產(chǎn)、血袋用的紅細(xì)胞保養(yǎng)液由山東威高公司生產(chǎn)，生理鹽水。以上試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 方法

1.3.1 本實(shí)驗(yàn)室的ABO血型檢測(cè)的正定型和Rh血型的檢測(cè)采用通用的微板法[3]，平時(shí)實(shí)驗(yàn)后稀釋板中的紅細(xì)胞未用完放2～6℃冰箱保存，稀釋液為采血袋用的紅細(xì)胞保養(yǎng)液，稀釋板跟其他酶標(biāo)板同時(shí)進(jìn)行條碼標(biāo)記，并打印微板布局，以確定每個(gè)微孔的獻(xiàn)血者編碼。

1.3.2 使用STAR加樣器上，參考文獻(xiàn)[3，4]的方法和參數(shù)，編寫的加樣方法實(shí)現(xiàn)了和站內(nèi)信息系統(tǒng)的雙向通訊，使用上述的平底板稀釋板，將濃度為5%的獻(xiàn)血者紅細(xì)胞加分別到5塊梯形板上，每塊120孔，一共600孔，每板設(shè)置一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔和一個(gè)陰性對(duì)照孔，加樣程序能夠自動(dòng)判定稀釋板的紅細(xì)胞對(duì)應(yīng)血液的血型、檢測(cè)結(jié)果和庫(kù)存狀態(tài)，共使用稀釋板20塊，一共選取590例O型及化驗(yàn)合格者，常規(guī)ABO血型檢測(cè)的日期為2015年12月1日到2015年12月8日，本次實(shí)驗(yàn)的時(shí)間為2015年12月20日。

1.3.3 將試劑抗-C和抗-e兩種等量混合，編號(hào)No. 1；將試劑抗-C和抗-e和Jka三種試劑等量混合，編號(hào)No.2；將試劑抗-C和抗-e和Jkb三種試劑等量混合，編號(hào)為No.3；將試劑抗-C和抗-e和抗-M三種試劑等量混合，編號(hào)為No.4；將試劑抗-C和抗-e和抗-N三種試劑等量混合，編號(hào)為No.5。No. 1陰性的表示C、e均陰性，No.2陰性的表示C、e、Jka均陰性，No.3陰性的表示C、e、Jkb均陰性，No.4陰性的表示C、e、M均陰性，No.5陰性的表示C、e、N均陰性。

1.3.4 用STAR加樣器將編號(hào)為No.1～No.5的5種試劑分別加入到已加獻(xiàn)血者標(biāo)本的5塊梯形板上，每孔25μl。陰性孔加入RhD陰性獻(xiàn)血者紅細(xì)胞和抗-D，陽(yáng)性孔加入RhD陽(yáng)性獻(xiàn)血者紅細(xì)胞和IgM抗-D。

1.3.5 將已加試劑的梯形微板放置微量在振蕩器上，設(shè)定振蕩頻率為35Hz和45Hz之間，振蕩20s，使孔內(nèi)紅細(xì)胞和抗體試劑充分混勻，然后靜置30min。有實(shí)心圓點(diǎn)的為陰性結(jié)果，均勻分布的為陽(yáng)性結(jié)果，記錄微孔位置，查找相應(yīng)的獻(xiàn)血者編碼。

1.3.6 用手工試管法進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，獻(xiàn)血者的標(biāo)本采用的是血辮子，方法參考文獻(xiàn)[5]，記錄全過(guò)程所需時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 梯形型板法篩選590例獻(xiàn)血者尋找相應(yīng)抗原陰性與手工試管法效果對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 梯形型板法篩選過(guò)程記錄見(jiàn)表2。

表2 梯形型板篩選過(guò)程記錄

2．3靈敏度比較試驗(yàn)每種抗體試劑選取一個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本，將每種抗體試劑稀釋2～64倍，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 使用紅細(xì)胞保養(yǎng)液和生理鹽水做稀釋液檢測(cè)效果對(duì)比只使用陰性對(duì)照孔和陽(yáng)性對(duì)照孔用紅細(xì)胞保養(yǎng)液做稀釋的紅細(xì)胞在懸浮紅細(xì)胞過(guò)期報(bào)廢之前均不影響結(jié)果，用生理鹽水稀釋的紅細(xì)胞在第5d就已經(jīng)輕度溶血，且無(wú)法分辨陰陽(yáng)性對(duì)照了，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.5 梯形型板法篩選實(shí)際使用結(jié)果記錄從2016年3月份到2016年9月份，本站共收到臨床送檢的4例含溫自身抗體的患者的疑難配血需求，因?yàn)榛颊哐逯泻陨砜贵w，常規(guī)方法無(wú)法為患者找到相合的血液，為防止自身抗體掩蓋同種抗體，采用本研究的方法為患者篩選血液，輸血后臨床均未見(jiàn)明顯輸血反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

含溫自身抗體的標(biāo)本，因紅細(xì)胞被致敏，血漿中存在自身抗體，無(wú)論是血清學(xué)檢測(cè)還是臨床的配合性試驗(yàn)，都是很難處理的問(wèn)題，常常困擾著輸血工作者?；颊哐逯凶陨砜贵w特別是含有溫自身抗體如果按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)將很難獲得相合的血液，因?yàn)樽陨砜贵w尤其是溫自身抗體的存在會(huì)干擾同種抗體的檢出；患者如果輸入含同種抗體對(duì)應(yīng)抗原陽(yáng)性的血液，可使其產(chǎn)生溶血性輸血反應(yīng)，嚴(yán)重的可能產(chǎn)生致命的危險(xiǎn)[6]。按照以往的做法是使用自身紅細(xì)胞，先進(jìn)行放散實(shí)驗(yàn)，放散掉黏附在自身紅細(xì)胞上的抗體，然后再吸收自身血清中的抗體，反復(fù)進(jìn)行多次，以此排除自身抗體的干擾[8]。然而在實(shí)際工作中，嚴(yán)重貧血的患者血樣中的紅細(xì)胞通常很少，做吸收放散實(shí)驗(yàn)很容易溶血，實(shí)驗(yàn)也非常繁瑣耗時(shí)，而且很難奏效。Shirey RS等學(xué)者提出對(duì)有溫自身抗體的或者難于鑒定同種抗體類型的患者，可作預(yù)防性供者抗原配型進(jìn)行血液輸注[7]。上海血液中心的向東等也提出使用Rh血型系統(tǒng)、MMS血型系統(tǒng)及Kidd血型系統(tǒng)抗原匹配的紅細(xì)胞輸注，就可基本上避免同種抗體引起的嚴(yán)重輸血反應(yīng)。以此省略復(fù)雜耗時(shí)的的自身吸收放散等操作，使患者得到及時(shí)有效的輸血治療[8]。對(duì)于有生育能力的女性患者的輸血，筆者認(rèn)為使用DCcEe抗原以及M、S、Jka、Jkb等抗原匹配的紅細(xì)胞輸注，就可基本上避免產(chǎn)生不規(guī)則抗體，從而最大限度防止因血型抗體導(dǎo)致的新生兒溶血病的發(fā)生。

表3 抗體試劑靈敏度檢測(cè)結(jié)果

表4 紅細(xì)胞保養(yǎng)液和生理鹽水做稀釋液檢測(cè)效果對(duì)比

表5 梯形型板法篩選實(shí)際使用結(jié)果記錄

在確定患者的Rh血型系統(tǒng)以及MMS血型系統(tǒng)及其他血型系統(tǒng)的抗原后，就需要篩選對(duì)應(yīng)抗原同樣也為陰性的血源，但如果遇到的是低頻率血型抗原陰性的紅細(xì)胞，醫(yī)院輸血科很難在庫(kù)存血中篩選出出相合的血液。輸血科此時(shí)只有請(qǐng)求血站協(xié)助篩選血液。血站篩選的方法一般使用試管法和微板法，試管法因?yàn)殡y于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)加樣，不適合進(jìn)行大批量的標(biāo)本篩選。如果使用傳統(tǒng)試管法進(jìn)行大批量的血源篩選，需要耗費(fèi)大量的時(shí)間來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)，可能會(huì)耽擱患者寶貴的搶救時(shí)機(jī)。國(guó)內(nèi)的羅海玲等使用U型板為疑難配血的患者進(jìn)行抗原篩選[10]，但是U型板法需要進(jìn)行離心和震蕩，不利于弱抗體的檢出，因而U型板法要求抗體試劑的效價(jià)較高，本實(shí)驗(yàn)采用微板法中抗原抗體反應(yīng)最為敏感的梯形板。梯型微板法原理是采用孔壁呈階梯狀的特殊V型微孔板，微孔內(nèi)發(fā)生相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)（凝集）時(shí)，紅細(xì)胞會(huì)彼此粘成凝塊，掛在階梯上，均勻分布于孔內(nèi)底面階梯上.未發(fā)生抗原抗體反應(yīng)(非凝集)時(shí)，紅細(xì)胞沿階梯滾落于孔底中央形成實(shí)心圓點(diǎn)，觀察微板的底部即可判定是否發(fā)生抗原抗體反應(yīng)[11]。

本實(shí)驗(yàn)所使用方法的紅細(xì)胞保養(yǎng)液取自成分分離紅細(xì)胞時(shí)，有些血袋破袋或者采集不足量的時(shí)候，將有剩余的紅細(xì)胞保養(yǎng)液，在一般情況下，將會(huì)丟棄，日常檢測(cè)ABO正定型和Rh血型的稀釋板也是做完實(shí)驗(yàn)就當(dāng)醫(yī)療垃圾進(jìn)行處理的，平時(shí)我們?yōu)榛颊吲溲男枰窖獛?kù)拿血袋的辮子來(lái)進(jìn)行，非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力。使用本研究所使用的方法方便快捷，不需要?jiǎng)佑毛I(xiàn)血者原始標(biāo)本和血袋的辮子，直接選擇保存在2～6℃冰箱含有獻(xiàn)血者紅細(xì)胞的稀釋板，可以為此類危重患者爭(zhēng)取寶貴的搶救時(shí)間。

受條件所限，本實(shí)驗(yàn)使用的抗體沒(méi)有包括Duffy，Lewis等其他血型系統(tǒng)，因而并不能100%保證避開(kāi)不規(guī)則抗體，有條件的血站可以加入其他血型系統(tǒng)的抗體，本組實(shí)際應(yīng)用標(biāo)本數(shù)也不多，需要用更長(zhǎng)時(shí)間和更大批量的實(shí)驗(yàn)去進(jìn)行驗(yàn)證。

[1]黃菲，李翠瑩，劉媛，等.2470例妊娠婦女不規(guī)則抗體篩查分析[J].臨床血液學(xué)雜志，2016，29(2)：115-119.

[2]李慧，徐煥銘，張毅，等.輸血前患者不規(guī)則抗體篩查及鑒定結(jié)果分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2015，23(3)：861-865.

[3]鐘展華，萬(wàn)小春，嚴(yán)鳳好.STAR加樣器智能化加樣的編程[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2016，34(2)：246-250.

[4]孫愛(ài)農(nóng)，黃麗雅，許惠根，等.自動(dòng)化微量板法檢測(cè)紅細(xì)胞不規(guī)則抗體的研究[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，22（6）：9-12.

[5]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.中國(guó)輸血技術(shù)操作規(guī)程（血站部分）[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，1998：71-74.

[6]許惠根，龐桂枝，胡利亞，等.溫自身抗體對(duì)血型檢定干擾的研究[J].廣州醫(yī)藥，2005，36(4)：59-60.

[7]孫國(guó)棟，向東.直接抗球蛋白試驗(yàn)陽(yáng)性患者體內(nèi)溫自身抗體特異性[J].中國(guó)輸血雜志，2001，14(6)：397.

[8]向東，劉曦，王健蓮，沈偉，等.紅細(xì)胞溫自身抗體的血清學(xué)特點(diǎn)分析及配血對(duì)策[J].中國(guó)輸血雜志，2008，21(12)：924-926.

[9]Shirey RS，Boyd JS，ParwaniAV，etal.Prophylactic antigenmatched donor blood for patients with warm autoantibodies：an algorithm for transfusion management[J].Transfusion，2002，42(11)：1435-1441.

[10]Geoff Daniels.人類血型[M].朱自嚴(yán)，譯.北京：科學(xué)出版社，2007：236-237.

[11]羅海玲，伍偉健，余晉林.自動(dòng)加樣快速微孔板法在疑難配血中的應(yīng)用[J].國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2010，16(24)：3018-3021.

R457.1+1

A

1674-1129(2017)03-0451-04

2017-03-09；

2017-04-14)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.056