許樹軍，鄒淑君*，孫永慧，肖洪彬

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040)

遼東楤木[Araliaelata(Miq.) Seem.]為五加科楤木屬植物，廣泛分布于中國(guó)東北地區(qū)。其葉在嫩芽期可作為山野菜食用，葉中提取的皂苷具有良好抗腫瘤作用，且抗腫瘤作用機(jī)理明確[1-2]，毒理學(xué)研究證明遼東楤木葉醇提物口服安全、無毒副作用[3]。由于葉可再生，資源豐富，有效利用能帶來很大的經(jīng)濟(jì)效益，因此越來越受到人們重視，有望開發(fā)為新藥。本研究擬采用紅外光譜法對(duì)遼東楤木葉進(jìn)行指紋圖譜分析。與其他中藥分析方法相比，紅外光譜法具有簡(jiǎn)便、快速、無損、成本低等特點(diǎn)[4-5]，近年來已被廣泛地應(yīng)用于中藥的各個(gè)領(lǐng)域。將紅外光譜分析法應(yīng)用于遼東楤木葉藥材分析，期望建立一種遼東楤木葉藥材質(zhì)量快速評(píng)價(jià)方法，并為遼東楤木葉采收時(shí)間提供指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

FTIR-8400S型傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津公司)；SSP-10A型粉末壓片機(jī)(日本島津公司)；WS70-1型紅外線快速干燥箱(上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

20批不同產(chǎn)地、不同采收期的遼東楤木葉干燥藥材粉末(過100目篩)，具體見表1。藥材經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)蘇連杰教授鑒定為五加科楤木屬植物遼東楤木(Araliaelata(Miq.) Seem.)的干燥葉。溴化鉀(光譜純)，其他試劑均為分析純。

表1 遼東楤木葉藥材信息

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試樣制備

取遼東楤木葉粉末約5.0 g，置500 mL具塞錐形瓶中，加50%乙醇200 mL，密塞，超聲提取1 h后，放冷，過濾，置于蒸發(fā)皿中濃縮至固體，固體加水100 mL混懸，用等體積水飽和的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，蒸干，得固體試樣，備用。

2.2 測(cè)試方法

溴化鉀壓片法測(cè)定室溫下的紅外光譜，取約3.0 mg試樣與0.2 g KBr置于瑪瑙研缽，在紅外干燥箱中研磨、壓片、于4 000～400 cm-1光譜范圍測(cè)試。

2.3 數(shù)據(jù)分析

用origin9.0作紅外圖譜，IR Solution Chinese 1.10(日本島津)紅外軟件進(jìn)行共有模式峰標(biāo)識(shí)及二階導(dǎo)數(shù)處理，SPSS19.0進(jìn)行相似度和聚類分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取2號(hào)藥材樣品，連續(xù)測(cè)定5次。圖譜之間的相關(guān)系數(shù)分別為：0.990 3、0.991 4、0.993 5、0.990 5、0.989 9,RSD為0.31%，說明儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取2號(hào)樣品壓片放入干燥器中保存，每隔2 h測(cè)試1次，共測(cè)定5次。圖譜之間的相關(guān)系數(shù)分別為：0.990 2、0.989 1、0.990 6、0.991 2、0.988 9，RSD為0.58%,表明樣品在10 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取2號(hào)樣品粉末5份進(jìn)行測(cè)試。圖譜之間的相關(guān)系數(shù)分別為：0.988 7、0.991 1、0.991 6、0.990 8、0.989 2，RSD為0.47%,表明測(cè)定方法符合重復(fù)性要求。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 紅外光譜指紋圖譜測(cè)定分析

對(duì)1～20號(hào)藥材樣品進(jìn)行紅外光譜測(cè)定，結(jié)果見圖1。

圖1 20批次遼東楤木葉提取物紅外光譜圖

遼東楤木葉藥材中所含化學(xué)成分主要有皂苷類、黃酮類、糖類化合物，除此以外，還有脂肪類、揮發(fā)油類、氨基酸以及蛋白質(zhì)類。從圖1可見， 20個(gè)產(chǎn)地遼東楤木葉藥材中，4、5、8、9、15號(hào)藥材的紅外光譜在532、1 045、1 076、1 161、1 261、1 392、1 408、1 458、1 604、2 854、2 924、3 367波數(shù)(cm-1)附近有明顯的吸收峰；其余的藥材紅外光譜在528、586、636、895、1 037、1 076、1 161、1 207、1 261、1 307、1 377/1 385、1 454、1 512、1 601、1 654(8月份的有，7、9月份的不全)、1 721、2 878、2 928、3 383波數(shù)(cm-1)附近都有吸收峰。5、9、15號(hào)為5月份藥材，4、8號(hào)為6月份藥材。在相同條件下測(cè)得不同批次的遼東楤木葉藥材提取物的紅外特征吸收峰中，8月份最多，5、6月份少。

3.2 紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)分析

紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)能有效提高紅外譜圖的分辨率，消除譜圖的背景和基線的影響，擴(kuò)大譜圖間的差異，因此導(dǎo)數(shù)譜是紅外光譜分析中的有效工具。圖2 是20批樣品紅外光譜的二階導(dǎo)數(shù)全圖。從圖中可以看出，5、9、15號(hào)圖譜峰數(shù)量偏少，說明不具備某些官能團(tuán)成分；且出現(xiàn)的峰強(qiáng)度均偏弱，說明某些成分含量偏低，這幾個(gè)樣品屬于5月份的樣品。其他樣品二階導(dǎo)數(shù)圖譜峰數(shù)量差別不大，但峰強(qiáng)度有一定的差別，4、8、14號(hào)屬于6月份樣品，在1 800～1 400 cm-1指紋區(qū)里峰強(qiáng)度低于同一地區(qū)7、8、9月份的峰強(qiáng)度，說明6月份某些成分含量較低。其他樣品基本都來源于7、8、9月份，譜峰數(shù)量及強(qiáng)度差別不明顯。

圖2 遼東楤木葉紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)圖譜

3.3 紅外光譜指紋圖譜共有模式建立

運(yùn)用平均值法建立紅外指紋圖譜共有模式，以此作為遼東楤木葉藥材的紅外光譜指紋圖譜。對(duì)于紅外指紋圖譜共有峰的確定方法是：一組吸收峰，若組內(nèi)吸收峰的波數(shù)最大差異顯著小于其與相鄰組之間的平均波數(shù)差，這組峰就應(yīng)是一組共有峰。20個(gè)測(cè)試樣品中，去掉5、9、15號(hào)屬于5月份的樣品，分析剩余17個(gè)樣品的紅外光譜峰，其共有模式及共有峰見圖3。

3 379cm-1附近強(qiáng)寬峰吸收峰，為-O-H或-N-H的伸縮振動(dòng)峰υ(O-H)、υ(N-H)，2 932 cm-1和2 878 cm-1附近尖吸收峰，為-C-H伸縮振動(dòng)峰υ(C-H)，其中峰型不同，表明-CH3和-CH2-含量不同，1 720 cm-1附近為羰基-C=O伸縮振動(dòng)峰υ(C=O)，1 654 cm-1、1 605 cm-1附近為-C=C-伸縮振動(dòng)峰υ(C=C)，1 377 cm-1附近為-C-O-伸縮振動(dòng)峰υ(C-O)，1 076及1 377 cm-1附近為苷類、萜類、多糖等碳水化合物C-O彎曲振動(dòng)峰δ(C-O)。這些均為糖類、氨基酸類分子的特征吸收峰[5]。

圖3 遼東楤木葉提取物紅外光譜指紋圖譜及共有峰

3.4 相似度分析

對(duì)20個(gè)樣品的紅外光譜進(jìn)行了相似度分析，結(jié)果見表2。從表2可以看出，不同批次遼東楤木葉藥材的紅外光譜相似度相差較大，相似度數(shù)值在0.209～0.990之間，說明不同批次遼東楤木葉藥材紅外吸收表現(xiàn)出一定的差異性。特別是4、5、8、9、14、15號(hào)樣品與其他樣品相似度差別大，這些樣品分別來自不同地區(qū)5、6月份。來自不同地區(qū)的7、8、9月份樣品相似度差別不大，幾乎都在0.70以上。

3.5 聚類分析

采用SPSS19.0軟件對(duì)紅外光譜進(jìn)行比對(duì)，在400～4 000 cm-1選取吸光度值作為吸光度矩陣，用組間聯(lián)接聚類法對(duì)20個(gè)遼東楤木葉樣品進(jìn)行聚類分析，分析結(jié)果見圖4。由圖可知，5、9、15號(hào)聚為一類，為5月份藥材，其他為一類?？梢?月份遼東楤木葉與其他月份比較不屬于同一類，原因是其官能團(tuán)峰少，而且含量極低。其他不同地區(qū)不同采收期的遼東楤木葉歸為一類，說明其共性官能團(tuán)峰相近。

表2 不同批次遼東楤木葉藥材樣品紅外指紋圖譜相似度

圖4 遼東楤木葉紅外光譜聚類分析圖

4 結(jié)論

20批不同產(chǎn)地、不同采收期的遼東楤木藥材紅外光譜及其二階導(dǎo)數(shù)給出的信息是5月份樣品譜峰數(shù)目少，且譜峰強(qiáng)度低，說明5月份藥材某些特征官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)成分還沒有形成。6、7、8、9月份的樣品，樣品成分幾乎都含有共同的特征結(jié)構(gòu)，但6月份的峰強(qiáng)度低。說明骨架成分在6月份已經(jīng)形成，但是含量低。7、8、9月份采收的遼東楤木葉藥材成分結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定、且含量差別小。同一時(shí)期不同產(chǎn)地的遼東楤木葉藥材的紅外圖譜無明顯差別。指紋圖譜分析結(jié)果表明我國(guó)東北地區(qū)遼東楤木葉50%乙醇、正丁醇萃取物在3 383、2 928、2 878、1 721、1 601、1 454、1 377/1 385、1 307、1 261、1 207、1 161、1 076、1 037、895、636、586、528 cm-1附近都有穩(wěn)定吸收峰。因此確定紅外指紋圖譜能夠在一定程度上評(píng)價(jià)遼東楤木葉藥材的質(zhì)量。7、8、9月份遼東楤木葉供試品的紅外指紋圖譜相似度大，且聚為一類，均能達(dá)到IR指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)。因此，從紅外指紋圖譜及相關(guān)分析可初步確定，東北不同地區(qū)采收于7、8、9月份的遼東楤木葉均符合藥用標(biāo)準(zhǔn)。