李慧，馬德志，姜明，劉溪，陳曉婷，劉振艷

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

傳統(tǒng)中藥繼承了數(shù)千年歷史精華的積累，在現(xiàn)代疾病預(yù)防和治療方面具有自身的優(yōu)越性和特點。隨著質(zhì)譜色譜技術(shù)的快速進(jìn)步，促進(jìn)了中藥有效成分的發(fā)現(xiàn)與鑒定，然而尚有許多中醫(yī)藥理論缺少現(xiàn)代自然科學(xué)的支撐和驗證[1]。隨著人類基因組計劃的完成，人類探索生物的發(fā)展規(guī)律進(jìn)入了后基因組時代，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和基因組學(xué)等逐漸被廣泛應(yīng)用。其中轉(zhuǎn)錄組學(xué)的應(yīng)用最為廣泛，發(fā)展也最為迅速，不僅是研究細(xì)胞表型和功能的重要手段，也是研究基因結(jié)構(gòu)、基因功能及表達(dá)的新的研究方法[2]。廣義的轉(zhuǎn)錄組(Transcriptome)是指生物體細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下所轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，包括能夠編碼蛋白質(zhì)的RNA(即mRNA)和不能編碼蛋白質(zhì)的RNA(rRNA,tRNA,microRNA等)。狹義的轉(zhuǎn)錄組指所有編碼蛋白質(zhì)的mRNA總和。

近年來，隨著DNA高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，大規(guī)模測序技術(shù)(如Roche公司的454 GS-FLX、Illumina公司的Genome Analyzer II和ABI公司的AB SOLiD))的出現(xiàn)徹底顛覆了轉(zhuǎn)錄組研究的方式，由傳統(tǒng)的基因芯片技術(shù)發(fā)展到RNA測序技術(shù)(RNA-seq)，也稱為轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)。該技術(shù)以高通量的方式揭示特定時間、特定組織或細(xì)胞中基因的全部表達(dá)情況、測定轉(zhuǎn)錄水平的SNP/Indel/SSR等遺傳多態(tài)性情況、識別相同基因的選擇性剪切或拼接情況、檢測未知基因等。目前，RNA-seq技術(shù)已成功應(yīng)用于動物、植物、微生物等各類生物當(dāng)中。在動物(例如：半番鴨[3]、黃牛[4]、山羊[5]等)研究中主要涉及到疾病研究、關(guān)鍵基因發(fā)掘及基因剪切等方面。而植物轉(zhuǎn)錄組研究則顯示出更加巨大的應(yīng)用潛能，例如：Wang等利用Illumina HiSeq 2000技術(shù)研究了枸橘的轉(zhuǎn)錄組序列特征，并篩選出參與冷調(diào)控途徑的相關(guān)基因與轉(zhuǎn)錄因子[6]。Zhang等研究東方百合轉(zhuǎn)錄組信息，獲得39 636條Unigene序列并篩選出156個與類黃酮生物合成途徑相關(guān)的關(guān)鍵酶基因，從而為花色形成的分子機(jī)理及分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)[7]。自2010年以來，RNA-seq技術(shù)在中藥材中的應(yīng)用也越來越廣泛，例如，人參[8]、冬蟲夏草[9]、燈籠果[10]等傳統(tǒng)中藥材都進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組的測序和分析。

本文參考已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組測序研究文獻(xiàn)，概括了轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在藥用植物領(lǐng)域中的應(yīng)用及取得的成果，并對該技術(shù)在藥用植物中的后期研究進(jìn)行展望。

1 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)方法

到目前為止，用于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲取和分析的測序方法主要經(jīng)歷了三代技術(shù)類型的變遷(見表1)：1)第一代測序技術(shù)主要有以Sanger測序作為基礎(chǔ)的SAGE(serial analysis of gene expression)和MPSS(massively parallel signature sequensing)、以PCR為基礎(chǔ)的全長cDNA文庫和EST(expressed sequence tag)文庫的測序分析。2)第二代測序技術(shù)即RNA-seq技術(shù)，是以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為代表的新一代測序技術(shù)，該技術(shù)可實現(xiàn)快速、大批量轉(zhuǎn)錄組檢測。鑒于其通量高、分辨率高、靈敏度高、不受限制等優(yōu)點，使得RNA-seq技術(shù)成為目前轉(zhuǎn)錄組測序研究的主導(dǎo)方法。3)第三代測序技術(shù)是近年來建立在第二代測序基礎(chǔ)之上興起的以PacBio為代表的測序技術(shù)，該技術(shù)可獲得更長乃至全長轉(zhuǎn)錄組序列。目前，第三代測序技術(shù)應(yīng)用較少但發(fā)展迅猛，將會為組學(xué)和生物信息學(xué)研究帶來新一輪的機(jī)遇。

表1 三代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)比較

2 藥用植物轉(zhuǎn)錄組測序研究現(xiàn)狀及應(yīng)用

2.1 藥用植物轉(zhuǎn)錄組測序現(xiàn)狀

RNA-seq已經(jīng)成功用于水稻、擬南芥、玉米等模式生物當(dāng)中，而大多數(shù)中藥材植物作為非模式生物，缺乏相關(guān)基因組信息。因此，RNA-seq成為藥用植物新基因挖掘、功能預(yù)測等重要的研究方法，已在國內(nèi)外大規(guī)模開展，比如丹參[17]、西洋參[18]、甘草[19]等。目前， 已經(jīng)有超過50種傳統(tǒng)藥用植物通過RNA-seq 進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組研究，尤其2014年以來，RNA-seq技術(shù)發(fā)展極為迅速，見表2。

表2 藥用植物轉(zhuǎn)錄組研究明細(xì)

2.2 藥用植物轉(zhuǎn)錄組測序應(yīng)用

2.2.1 藥用植物發(fā)育機(jī)制研究

長期以來，中藥材種植缺乏優(yōu)良的管理與品種選育技術(shù)，導(dǎo)致品種退化、抗逆性差等問題嚴(yán)重?，F(xiàn)代轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可以從整體水平上研究藥用植物種質(zhì)資源的代謝途徑與調(diào)控機(jī)制，深入開展藥用植物轉(zhuǎn)錄組研究有助于揭示生長發(fā)育過程中的關(guān)鍵影響因素，為藥用植物栽培育種提供指導(dǎo)。鄧楠等[71]利用RNA-seq技術(shù)獲得6個不同發(fā)育時期膜果麻黃種子轉(zhuǎn)錄組信息，KEGG分析表明種子萌發(fā)期間共有16 748個編碼基因參與了125個代謝通路，其中代謝途徑參與基因最多，占所有編碼基因的22.5%(3 768個)；其次是次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑占11.27 %(1 888個)；再次是植物激素信號傳導(dǎo)編碼基因占4.54 %(761個)。Mehta等[63]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)參與番瀉葉干旱脅迫響應(yīng)的基因涉及到植物激素信號傳導(dǎo)、滲透活性物質(zhì)、活性氧清除、葉綠素代謝途徑和信號因子等方面。進(jìn)一步基因表達(dá)分析表明存在6個基因(轉(zhuǎn)錄因子MYC2，9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶，L抗壞血酸過氧化物酶，氨基環(huán)丙烷羧酸氧化酶，8′羥化酶，WRKY轉(zhuǎn)錄因子)與干旱脅迫密切相關(guān)。唐娟[55]對3個不同品種茯苓進(jìn)行品質(zhì)特征分析和轉(zhuǎn)錄組測序研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靖航一號在加工性能和有效成分含量方面占有優(yōu)勢，通過轉(zhuǎn)錄組測序和基因差異表達(dá)分析發(fā)掘出673個新基因，并篩選出與茯苓多糖代謝相關(guān)的4個關(guān)鍵基因。

2.2.2 次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑研究

次生代謝產(chǎn)物是藥用植物的重要組成部分，其種類繁多，主要有含氮有機(jī)物、生物堿、萜類、酚類、黃酮類及有機(jī)酸等。次生代謝產(chǎn)物不僅是藥用植物適應(yīng)環(huán)境壓力，提高生存競爭能力，抵抗生物和非生物脅迫的重要角色，而且是具有廣泛藥用價值的生物活性物質(zhì)。藥用植物具有作用靶點多，組分復(fù)雜的特點，通過轉(zhuǎn)錄組測序解析次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑并挖掘關(guān)鍵酶基因，可為藥用植物活性成分的積累和高效利用提供科學(xué)依據(jù)。朱孝軒[72]利用二代測序技術(shù)和三代測序技術(shù)同時對長春花的葉、花和根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和分析，通過二代測序篩選出可能參與吲哚生物堿(TIAs)合成的8個P450候選基因和5個功能基因，通過三代測序發(fā)現(xiàn)了與TIAs途徑有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及可能參與TIAs途徑的調(diào)控催化酶編碼基因的可變剪切，克隆了所有環(huán)烯醚萜途徑的催化酶基因并構(gòu)建了3個基因的表達(dá)模塊，為探索完整TIAs途徑在酵母中的重建奠定了基礎(chǔ)。Li等[57]研究了金釵石斛中石斛堿生物合成途徑關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)了可能參與倍半萜骨架合成相關(guān)的30個蛋白編碼基因序列，其中的MF23通過調(diào)節(jié)MVA途徑中的基因表達(dá)影響石斛堿的生物合成。并推測后修飾酶在石斛堿的生物合成中發(fā)揮了重要作用。

2.2.3 藥用植物SSR分子標(biāo)記的開發(fā)

Simple sequence repeat (SSR)分子標(biāo)記也稱為微衛(wèi)星DNA多態(tài)性標(biāo)記，由2～6 bp的基本重復(fù)單元組成。SSR分子標(biāo)記能按孟德爾規(guī)律穩(wěn)定地遺傳與分離，在藥用植物基因組中散布著大量的串聯(lián)重復(fù)序列，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性、覆蓋面廣、易檢測、操作簡單等優(yōu)點，已在遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和分子標(biāo)記輔助育種、遺傳多樣性分析和品種及純度鑒定等方面得到廣泛應(yīng)用。利用轉(zhuǎn)錄組測序獲得SSR分子標(biāo)記，可不依賴于全基因組信息，快速和廉價地獲得大量的重復(fù)序列位點，避免全基因組測序周期長、成本高的缺點，也可避免EST-SSR信息量少的問題。目前，已廣泛應(yīng)用于丹參、沙棘、甘草、茯苓及羅漢果等多種藥用植物中。李翠婷等[73]分析了野三七轉(zhuǎn)錄組中的SSRs位點信息，共搜索到21 320個SSRs，分布于17 780條unigenes中，SSRs位點出現(xiàn)頻率為16.82%。利用15對具有多態(tài)性的引物對13個野三七材料進(jìn)行遺傳多樣性分析并將其分為2類。Liu等[74]檢測到2 446條大蒜EST-SSRs，這些序列中AGA/TCT和GAA/TTC重復(fù)基元頻率最高(66.1%)，并將其中的1 506條序列設(shè)計成SSR引物。隨機(jī)選擇200對引物對大蒜及其他5個不同百合科品種進(jìn)行擴(kuò)增，有效擴(kuò)增引物分別為194對和155～186對，表明這些引物具有很好的種間通用性，為圖譜構(gòu)建、QTL定位、遺傳多樣性分析和關(guān)聯(lián)作圖等提供了支撐。代嬌等[75]在16 369條厚樸轉(zhuǎn)錄組序列中共獲得8 635個SSRs位點，出現(xiàn)頻率為52.75%。SSR 序列中單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸為優(yōu)勢重復(fù)類型，主導(dǎo)重復(fù)基元類型為 A/T(47.16%)、AG/CT(31.74%)、AAG/CTT(6.53%)。45對引物中22對(48.89%)可以擴(kuò)增出預(yù)期大小的條帶。含SSR的Unigene與能量和氧化還原等代謝過程，以及 RNA 轉(zhuǎn)運、剪接體和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路有關(guān)，這些SSR序列的獲得將為厚樸基因挖掘和分子標(biāo)記輔助育種提供有利的工具。

3 展望

本文在簡要介紹轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的基礎(chǔ)上，從藥用植物發(fā)育機(jī)制、次生代謝產(chǎn)物生物合成和SSR分子標(biāo)記開發(fā)等3個方面綜述了國內(nèi)外近年來在藥用植物轉(zhuǎn)錄組研究方面的應(yīng)用成果。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)具有通量高、覆蓋范圍廣、精度高、不依賴于基因組參考序列等特點，適用于所有模式和非模式生物，使得轉(zhuǎn)錄組測序成為藥用植物經(jīng)濟(jì)有效的研究工具。通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，將有助于挖掘新的功能基因和代謝通路，為天然藥物來源新途徑，探索藥用植物道地性形成的分子機(jī)制提供新的思路和方法。通過對次生代謝途徑關(guān)鍵酶基因的研究，為藥用植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成與含量調(diào)控提供分子基礎(chǔ)。通過SSR分子標(biāo)記的開發(fā)，構(gòu)建藥用植物指紋圖譜，為分子標(biāo)記輔助育種，種質(zhì)資源收集、鑒定與評價提供技術(shù)支撐。轉(zhuǎn)錄組的研究能夠?qū)斫馑幱弥参锏纳韺W(xué)和生物化學(xué)的各個方面提供新的信息，為中醫(yī)藥理論提供現(xiàn)代分子生物學(xué)的支撐和驗證。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)作為后基因組時代發(fā)展起來的一項測序技術(shù)，必將成為今后應(yīng)用最廣的分析技術(shù)，將有更多的藥用植物會采用轉(zhuǎn)錄組測序方法來了解其基因的表達(dá)、功能。結(jié)合新興的蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)研究，實現(xiàn)高通量與高效率的結(jié)合，助力傳統(tǒng)中藥的現(xiàn)代化進(jìn)程。