劉樹(shù)沅，韋劍洪，陳偉輝，霍駿業(yè)

(廣東省中山市博愛(ài)醫(yī)院生殖中心 528403)

依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查顯示，已婚育齡夫婦的不孕癥發(fā)生率約為10%，其中男性不育因素占總不孕患者的40%[1]，而在國(guó)內(nèi)由于二孩政策開(kāi)放和環(huán)境污染等因素，這一比例還有一定的升高[2]。為幫助不孕夫婦，輔助生殖技術(shù)(ART)得到了廣泛應(yīng)用，由于只有發(fā)生頂體反應(yīng)的精子才能完成受精，檢測(cè)精子是否已經(jīng)發(fā)生頂體反應(yīng)已成為評(píng)價(jià)精子質(zhì)量和功能的重要指標(biāo)，高于10%的自發(fā)頂體反應(yīng)率則表現(xiàn)為病理性自發(fā)頂體反應(yīng)升高，因此在男性不育的治療中調(diào)整自發(fā)頂體反應(yīng)率是治療的重點(diǎn)目標(biāo)[3]。在常規(guī)體外受精(IVF)中，密度梯度離心法和上游法常用于優(yōu)化精子，是篩選不同頂體反應(yīng)率精子簡(jiǎn)單、易行的方式。本文研究了精子自發(fā)頂體反應(yīng)率以及兩種精子處理方法與IVF胚胎質(zhì)量的關(guān)系，探討更合適的精液處理方法以及自發(fā)頂體反應(yīng)率在臨床指導(dǎo)授精方式方面的應(yīng)用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年3月至2016年2月在本院生殖中心接受IVF治療的不孕夫婦200對(duì)，男方年齡(33.9±5.1)歲，女方年齡(29.6±5.3)歲，每周期獲卵數(shù)(11.5±3.2)個(gè)。將所有患者分為觀(guān)察組和對(duì)照組，每組不孕夫婦100對(duì)，兩組間男女年齡和周期獲卵數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn)：女年齡≥37歲，獲卵數(shù)<5個(gè)者，男方嚴(yán)重少、弱精或無(wú)精子癥者。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集和處理 按照《WHO實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第5版)采集和處理精液。不育男性患者需禁欲2～7 d，IVF當(dāng)天通過(guò)手淫法取精，精液收集在無(wú)毒、無(wú)菌容器內(nèi)，放置于溫度為37 ℃的恒溫板上，充分液化后混勻待用。

1.2.2對(duì)照組精子優(yōu)化 采用密度梯度離心法處理。取40%和80% 精子梯度分離液(商品名:Sperm Grad)各1 mL，復(fù)溫后在15 mL離心管內(nèi)依次放入80%和40%精子梯度分離液各1 mL，注意保持液面分界清晰，在40%精子梯度分離液上方加入液化后的精液，300×g離心20 min，除去上清液，將沉淀移入3 mL G-IVF受精液中混勻，200×g離心5 min，去上清液，留約0.5 mL底層液體及沉淀，混勻后調(diào)整濃度備用。

1.2.3觀(guān)察組精子優(yōu)化 采用密度梯度離心法聯(lián)合上游法處理。密度梯度離心法處理步驟同上，第2次離心處理后，棄上清液，將沉淀緩慢加入到含1 mL G-IVF受精液的小試管底部，傾斜放置，上游25～45 min，吸取云霧狀的上層液體調(diào)整濃度后備用。

1.2.4授精方法和胚胎觀(guān)察 取卵當(dāng)天，患者注射絨毛膜促性腺激素(HCG)后38.5～40.0 h進(jìn)行常規(guī)IVF授精，授精后17～19 h觀(guān)察受精情況，計(jì)算受精率；授精后第3天觀(guān)察胚胎發(fā)育情況，計(jì)算優(yōu)胚率。

1.2.5精子自發(fā)頂體反應(yīng)率檢測(cè) 采用絡(luò)合異硫氰酸熒光素的豌豆凝集素(FITC-PSA)熒光標(biāo)記法頂體染色，使用安徽安科生物工程股份有限公司提供的試劑盒。取優(yōu)化處理后的精子懸浮液5 μL涂片2張，自然干燥后以95%乙醇固定30 min。加入60～100 μL FITC-PSA工作液，4 ℃下反應(yīng)2～17 h；用純水沖片，1 000 倍油鏡下觀(guān)察，計(jì)數(shù)200個(gè)精子，計(jì)算自發(fā)頂體反應(yīng)率。頂體完整精子判斷標(biāo)準(zhǔn)為(1)頂體完整(AI)：精子頭部有超過(guò)1/2熒光染色明亮且具有均勻性；(2)已發(fā)生頂體反應(yīng)(AB)：精子僅在赤道帶存在熒光帶，或頂體區(qū)無(wú)熒光染色；(3)頂體異常：除上述兩類(lèi)精子之外的所有精子。

1.3觀(guān)察指標(biāo) 記錄觀(guān)察組自發(fā)頂體反應(yīng)率，兩組的受精率和優(yōu)胚率。自發(fā)頂體反應(yīng)率=頂體反應(yīng)數(shù)/(頂體反應(yīng)數(shù)+AI)×100%。頂體反應(yīng)為已發(fā)生頂體反應(yīng)精子，AI為頂體完整的精子。受精率=受精卵子數(shù)/獲卵數(shù)×100%，優(yōu)胚率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN受精卵數(shù)×100%，其中優(yōu)質(zhì)胚胎是指D3評(píng)分為7Ⅰ、7Ⅱ、8Ⅰ、8Ⅱ、9Ⅰ或9Ⅱ的胚胎。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；自發(fā)頂體反應(yīng)率與受精率和優(yōu)胚率的相關(guān)性用Spearman檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組間受精率比較及與自發(fā)頂體反應(yīng)率相關(guān)性 對(duì)照組受精率為53.6%，觀(guān)察組受精率為70.9%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀(guān)察組自發(fā)頂體反應(yīng)率為16.9%，與受精率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.890，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 自發(fā)頂體反應(yīng)率與受精率相關(guān)性

2.2兩組間優(yōu)胚率比較及與自發(fā)頂體反應(yīng)率相關(guān)性 對(duì)照組優(yōu)胚率為43.6%，觀(guān)察組優(yōu)胚率為55.9%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀(guān)察組自發(fā)頂體反應(yīng)率為16.9%，與優(yōu)胚率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.647，P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 自發(fā)頂體反應(yīng)率與優(yōu)胚率相關(guān)性

3 討 論

IVF是幫助不孕不育夫婦妊娠的重要治療手段，在IVF治療過(guò)程中，最為重要的就是提高受精率和優(yōu)胚率，以達(dá)到改善不孕不育患者妊娠結(jié)局的目標(biāo)[4]。精液處理技術(shù)是男性不育治療的重要手段，其中上游法和密度梯度離心法是目前精子優(yōu)化處理的常用技術(shù)。上游法是利用精子自身的活動(dòng)能力上游到培養(yǎng)液上層而進(jìn)行優(yōu)化，密度梯度離心法則根據(jù)精子密度利用離心力篩選精子，二者都能提高活動(dòng)精子的百分率，上游法回收率較低。本文研究顯示，觀(guān)察組的受精率和優(yōu)胚率均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，密度梯度離心法聯(lián)合上游法能夠選出質(zhì)量更好的精子，有利于提高胚胎質(zhì)量。

頂體反應(yīng)是精子在受精過(guò)程中所經(jīng)歷的重要環(huán)節(jié)之一，在受精過(guò)程中精子必須完成頂體反應(yīng)，釋放頂體細(xì)胞溶解酶，使得精子在穿透透明帶過(guò)程中產(chǎn)生一條軌道，協(xié)助精子穿過(guò)透明帶與卵子結(jié)合[5]，如果精子在與透明帶結(jié)合之前便發(fā)生自發(fā)頂體反應(yīng)，則會(huì)失去受精能力，因此檢測(cè)精子是否發(fā)生頂體反應(yīng)已成為評(píng)價(jià)精子質(zhì)量和功能的重要手段。目前，大多數(shù)頂體反應(yīng)試驗(yàn)方法是使用各類(lèi)的誘導(dǎo)劑或激動(dòng)劑，如人卵泡液、孕酮或鈣離子載體等[6]。這些試驗(yàn)都具有費(fèi)用高、不穩(wěn)定等特點(diǎn)，臨床應(yīng)用受限。本研究采用FITC-PSA熒光標(biāo)記法頂體染色對(duì)精子頂體功能進(jìn)行檢測(cè)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)精子頂體完整性進(jìn)行科學(xué)評(píng)估，同時(shí)該種檢測(cè)方法能夠解決常規(guī)形態(tài)學(xué)方法不能有效判別精子自發(fā)頂體反應(yīng)的問(wèn)題，檢測(cè)結(jié)果更具客觀(guān)性和科學(xué)性[7]。

通過(guò)人工誘導(dǎo)發(fā)生頂體反應(yīng)在臨床上有大量研究。LIU等[8]在對(duì)鈣離子載體A23187誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)精子形態(tài)及體外受精率進(jìn)行的兩次研究就出現(xiàn)過(guò)結(jié)果不一致現(xiàn)象；而LIU等[9]采用人卵泡液對(duì)精子頂體反應(yīng)進(jìn)行誘導(dǎo)，觀(guān)察到頂體反應(yīng)率與體外受精率存在明顯相關(guān)性，但是李建平等[10]的研究結(jié)果卻與之相悖。這提示在使用人工誘導(dǎo)頂體反應(yīng)的嘗試中仍存在穩(wěn)定性差、成本高等難題。本文研究結(jié)果顯示，自發(fā)頂體反應(yīng)率與受精率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.890，P<0.05)，與優(yōu)胚率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.647，P<0.05)，提示降低精子自發(fā)頂體反應(yīng)率可以提高受精率和優(yōu)胚率，有助于改善IVF的成功率和妊娠結(jié)局。另外，對(duì)于常規(guī)精液分析正常，而IVF不明原因反復(fù)受精失敗的患者，可能存在頂體反應(yīng)缺陷，可以通過(guò)檢測(cè)精子自發(fā)頂體反應(yīng)率考慮優(yōu)先采用何種授精方式。對(duì)于自發(fā)頂體反應(yīng)率明顯升高的患者，可考慮選擇卵子胞質(zhì)內(nèi)單精子注射的輔助生殖技術(shù)，而用于選擇授精方式的自發(fā)頂體反應(yīng)率參考閾值，則需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究和探討。

綜上所述，密度梯度離心聯(lián)合上游法可以獲得更好的受精率和優(yōu)胚率，自發(fā)頂體反應(yīng)率與組間IVF受精率呈負(fù)相關(guān)，隨自發(fā)頂體反應(yīng)率的增加，受精率呈降低的趨勢(shì)；自發(fā)頂體反應(yīng)率與組間IVF優(yōu)胚率呈負(fù)相關(guān)，隨自發(fā)頂體反應(yīng)率的增加，優(yōu)胚率呈降低的趨勢(shì)。自發(fā)頂體反應(yīng)率可以為不孕不育患者臨床治療方式的選擇提供指導(dǎo)。

[1]WORLD HEALTH ORGANIZATION.Sexual and reproductive health beyond 2014:equality,quality of care and accountability[M].Geneva：WHO，2014：1-8.

[2]楊黎明,張富青,劉敏.河南省育齡女性生育情況流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥,2016,23(4):153-155.

[3]ESTERHUIZEN A D,FRANKEN D R,LOURENS J G,et al.Clinical importance of zona pellucida-induced acrosome reaction and its predictive value for IVF[J].Hum Reprod,2001,16(1):138-144.

[4]PRACTICE COMMITTEE OF THE AMERICAN SOCIETY FOR REPRODUCTIVE MEDICINE;PRACTICE COMMITTEE OF THE SOCIETY FOR ASSISTED REPRODUCTIVE TECHNOLOGY.Role of assisted hatching in in vitro fertilization:a guideline[J].Fertil Steril,2014,102(2):348-351.

[5] BEDFORD J M.Site of the manmalian sperm physilolgical acrosome reaction[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(12):4703-4707.

[6]陳瑩,李昆明.精子頂體反應(yīng)及其相關(guān)調(diào)控因子研究進(jìn)展[J].中國(guó)婦幼保健,2016,31(9):2011-2013.

[7]張冉，丘映.精子正常形態(tài)率、頂體完整率、頂體反應(yīng)率與卵子體外受精率的相關(guān)性研究[J].中國(guó)民康醫(yī)學(xué),2012,24(19):2305-2306.

[8]LIU D Y,BAKER H W.Evaluation and assessment of semen for IVF/ICSI[J].Asian J Androl,2002,4(4):281-286.

[9]LIU D Y,LIU M L,GARRETT C,et al.Comparison of the frequency of defective sperm-zona pellucida(ZP) binding and the ZP-induced acrosome reaction between subfertile men with normal and abnormal semen[J].Hum Reprod,2007,22(7):1878-1884.

[10]李建平,鐘影,吳東,等.人卵泡液誘導(dǎo)的頂體反應(yīng),精子形態(tài)與體外受精率的關(guān)系[J].中華男科學(xué)雜志,2006,12(7):605-607.