常天晴，吳華，馮睿芝，錢云

精子發(fā)生由一系列復雜而精細的生物學過程構成，主要包括有絲分裂、減數分裂和精子變形。精子變形是指減數分裂后期形成的單倍體圓形精子細胞經過一系列的形態(tài)變化最終成為成熟精子的過程，包括染色質重塑、頂體形成、線粒體重排、鞭毛組裝和細胞質殘余體移除等[1]。頂體形成是精子變形過程中的重要事件，涉及前頂體囊泡的形成和運輸、前頂體囊泡的融合、頂體在細胞核上的附著等主要生物學事件。精子頂體各階段的發(fā)育均受到相關蛋白的精確調控，蛋白之間相互作用并表現出復雜的分子調控機制，相關蛋白的異常導致精子頂體結構異常和功能障礙，從而引起男性生育力減退甚至不育。有研究發(fā)現，自噬機制參與了頂體形成過程中高爾基體源性囊泡運輸和融合過程[2]。盡管對于精子發(fā)生過程中頂體的形態(tài)變化已有充分的研究，但其精確的分子調控機制仍有待進一步的發(fā)掘。本文按照頂體發(fā)育相關的生物學事件發(fā)生順序，對近年相關蛋白的研究進行綜述，以探討頂體形成背后復雜的蛋白調控網絡，并提出了未來進一步的研究方向。

1 頂體的形成及其功能

1.1 頂體的形成頂體的形成分為四個階段：高爾基體階段、頂帽階段、頂體階段和成熟階段[3]。在高爾基體階段，高爾基體產生前頂體囊泡，之后對其進行分類并運送至核表面，在核表面前頂體囊泡融合形成一個大的頂體囊泡[4]。在頂帽階段，頂體囊泡變大，糖蛋白含量增加，并擴散到細胞核上形成類似帽子的結構。在頂體階段，頂體發(fā)生縮合并附著在頂體內膜上，染色質凝聚。最后的成熟階段細胞核繼續(xù)濃縮，核形態(tài)發(fā)生變化，頂體發(fā)生遷移，頂體顆粒遍布整個頂體膜，頂體分化為前部和后部[5]。

1.2 頂體的功能頂體是精子特有的細胞器，呈帽狀覆蓋在精子核的前部，其內充滿了促進精子-卵子相互作用的蛋白水解酶和受體。頂體是精子與透明帶結合和穿透的基礎，其幫助精子穿過放射冠和透明帶，釋放出一系列頂體酶并與卵母細胞融合，發(fā)生頂體反應，其正常形態(tài)和功能對受精起決定性作用。頂體反應是保證受精成功的關鍵步驟之一，在此過程中，外部的頂體膜與內部的精子細胞質膜融合，導致頂體酶的釋放，從而分解卵子的外部保護層，使精子到達卵子的細胞質[6]。

2 前頂體囊泡的形成和運輸相關蛋白

高爾基體相關囊泡的形成和運輸是頂體形成過程中的重要事件。液泡蛋白分選（vacuolar protein sorting，VPS）家族成員VPS13B定位于高爾基體膜，與高爾基體相關的小GTP酶RAB6相互作用[7]。Da Costa等[4]研究發(fā)現，VPS13B對于前頂體囊泡的正常運輸是必需的。VPS13B在高爾基體階段精子細胞的前頂體囊泡中表達，Vps13b-/-雄性小鼠不育，表現出嚴重的少弱畸形精子癥。VPS13B蛋白的缺失導致精子頂體發(fā)生受損，精子細胞的前頂體囊泡沒有到達核膜，而是最終被包裹在溶酶體中，精子細胞變形或形成異常圓頭精子細胞，精子濃度、活力均明顯降低。

Rab蛋白是一類小GTP酶，調節(jié)真核細胞內的小泡運輸；Rab2對于成熟降解的內溶酶體和自溶酶體的生成至關重要[8]。研究顯示，具有序列相似性的家族71成員F1（family with sequence similarity 71 member F1，FAM71F1）是睪丸優(yōu)勢表達蛋白，含有RAB2B結合區(qū)。也有研究發(fā)現睪丸組織FAM71F1的表達在男性不育患者中顯著下調[9]。Morohoshi等[6]研究表明，FAM71F1與活性RAB2A/B結合形成的復合物抑制了頂體形成過程中過度的囊泡運輸。Fam71f1-/-小鼠的精子頂體在圓形精子細胞階段異常擴張，頂體反應相關的精卵融合蛋白1（izumo spermegg fusion protein 1，IZUMO1）受到損害，因此FAM71F1對于正確的頂體形成和正常的雄性生育是必需的[6]。

最近的研究發(fā)現，纖維鞘相互作用蛋白（fibrous sheath interacting protein，FSIP）在頂體囊泡形成中具有重要作用。Gamallat等[10]研究發(fā)現，FSIP1不僅是一種纖維鞘細胞骨架蛋白，而且是一種參與長形精子細胞基本結構的必需蛋白。FSIP1缺失影響精子發(fā)生核心蛋白的表達，減弱了鞭毛內運輸蛋白的功能，顯著下調了大多數參與頂體囊泡形成的蛋白質，因而在頂體發(fā)生和鞭毛形成中發(fā)揮關鍵作用。FSIP1蛋白在圓形精子細胞中表達最高，與頂體囊泡蛋白1（acrosomal vesicle protein 1，ACRV1）相互作用，并在第9～12步精子形成期間從細胞核移位到頂體。Fsip1-/-小鼠是不育的，精子數量和活力顯著下降，精子頭部畸形，鞭毛組裝失敗，頂體囊泡破裂[10]。Fang等[11]研究發(fā)現，FSIP2過表達小鼠圓形精子細胞中上調基因在頂體囊泡中富集，FSIP2在頂體區(qū)域與ACRV1相互作用調節(jié)ACRV1蛋白的表達，進而參與頂體形成。Zheng等[12]通過全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）在弱精子癥患者中發(fā)現了新的雙等位基因FSIP2變異體，通過綜合形態(tài)學分析，在患者的精子中觀察到大量圓頭精子和（或）頂體發(fā)育不全精子，免疫熒光技術（immunofluorescence technique）顯示，FSIP2在人類和小鼠精子形成過程的各個時期的頂體中都有表達。進一步研究表明，FSIP2和參與頂體發(fā)育的蛋白[如熱休克蛋白90B1（heat shock protein 90 beta family member 1，HSP90B1）、KIAA1210、HSPA2]相互作用，并且FSIP2調節(jié)DPY19L2（dpy 19-like 2）和精子頂體相關蛋白1（sperm acrosome associated 1，SPACA1）的表達。

另有研究表明，著絲粒蛋白E（centromeric protein E，CENP-E）以緊湊的結構沿著微管運送相關物質[13]。She等[14]研究發(fā)現，CENP-E在精子發(fā)生過程中介導膜運輸和囊泡運輸，對頂體形成具有重要作用。小鼠睪丸長期注射變構抑制劑GSK923925特異性抑制CENP-E后，睪丸生精小管結構紊亂，生精過程中斷，長形精子細胞形態(tài)異常。組織化學及透射電子顯微鏡分析顯示，CENP-E被GSK923925抑制后，頂體形態(tài)不規(guī)則，頂體顆粒散在分布于細胞質中，高爾基體源性囊泡的數量顯著減少[14]。

3 前頂體囊泡融合相關蛋白

前頂體囊泡形成后被運輸至精子的細胞核表面，在細胞核表面相互融合形成一個大的頂體囊泡，相關蛋白異常會造成囊泡融合失敗從而影響頂體的正常發(fā)育。AU040320是一種高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，定位于質膜、核內體、高爾基體和反面高爾基體管網狀結構蛋白（trans Golgi network，TGN）。Guidi等[15]研究發(fā)現，AU040320蛋白定位于生殖細胞的TGN，但在成熟的頂體中未檢測到，表明該蛋白可能是前頂體囊泡正常形成所必需的。AU040320-/-雄性小鼠不育，精子運動能力受損，頭部畸形，缺乏頂體結構，進一步的精子超微結構分析顯示，前頂體囊泡在圓形精子細胞頂體附近積聚，但不能融合成單個頂體囊泡，最終導致頂體發(fā)育異常。

高爾基體基質蛋白130（Golgi matrix protein 130，GM130）是一種與高爾基體膜緊密結合的高爾基體基質蛋白，與高爾基體囊泡轉運蛋白P115和高爾基體重組與堆疊蛋白65（Golgi reassembly stacking protein 65，GRASP65）相互作用，在內質網囊泡與高爾基體膜融合過程中發(fā)揮重要作用，從而保持高爾基體結構的完整性[16]。研究發(fā)現，GM130-/-雄鼠不育，精子缺乏頂體結構、頭部呈圓形、線粒體鞘組裝異常，與人類圓頭精子癥特點一致[17]。免疫熒光結果顯示，精子發(fā)生過程中P115和GRASP65蛋白不能被募集到高爾基體中，導致高爾基體的碎片化，許多高爾基體衍生的前頂體囊泡聚集在髓質區(qū)而未能融合成單個大頂體囊泡[17]。此外，睪丸生精細胞中銜接蛋白1（adaptin 1）和TGN46的共定位被破壞，這表明頂體發(fā)生異?？赡苁怯捎谏毎懈郀柣w衍生的前頂體囊泡未能正確組裝而導致囊泡融合失敗，最終引起GM130-/-雄鼠完全不育[17]。

高爾基體微管相關蛋白210（Golgi-microtubuleassociated protein of 210 kDa，GMAP210）也被稱為甲狀腺激素受體相互作用物11（thyroid hormone receptor interactor 11，TRIP11），對維持高爾基體正常形態(tài)和功能起重要作用。GMAP210是鞭毛內轉運蛋白20（intraflagellar transport 20，IFT20）的高爾基膜受體，二者在高爾基體內共同發(fā)揮作用[18]。研究已證實IFT20在精子發(fā)生和雄性生殖中發(fā)揮重要作用[19]。Wang等[20]研究發(fā)現，GMAP210蛋白在睪丸和肝臟中高表達，在睪丸發(fā)育過程中GMAP210的表達水平隨年齡增長而增加。在頂體形成的正常過程中，前頂體囊泡的融合以及一些頂體蛋白的正常表達和定位都需要GMAP210參與。生殖細胞特異性Gmap210-/-雄性小鼠生育力顯著下降，精子頭部呈長橢圓形并缺乏頂體，進一步超微結構分析顯示，精子細胞中的高爾基體更加分散，前頂體囊泡沒有融合，因此不能形成帽狀頂體囊泡。此外，Gmap210-/-小鼠睪丸SPACA1、透明帶結合蛋白1（acrosomal protein zona pellucida binding protein 1，ZPBP1）和IFT20的表達水平顯著下降，IFT20在各級生精細胞中的定位亦發(fā)生異常[20]。

中心體蛋白70（centrosomal protein 70，CEP70）屬于CEP家族，在人類精子發(fā)生的不同階段都有表達，特別是在減數分裂和變形階段高表達[21]。CEP70還參與微管的伸展和動態(tài)調節(jié)[22]。Liu等[23]研究發(fā)現，小鼠CEP70的缺失導致與精子鞭毛、頭部、頂體和微管細胞骨架形成相關的蛋白顯著減少，精子發(fā)生受阻于Ⅶ期和Ⅷ期，大部分圓形精子細胞不能發(fā)育至長形精子細胞，Cep70-/-小鼠精子細胞高爾基體階段可以發(fā)現多個頂體結構，而頂帽階段和成熟階段檢測到空泡化或不規(guī)則形狀的頂體，頂體基質成分顯著下調，精子發(fā)生異常而最終引起不育。

4 頂體在細胞核上附著的相關蛋白

除了被運輸到細胞核表面并融合形成單個大的頂體囊泡外，頂體在細胞核上的附著對其功能也非常重要。DPY19L2蛋白在睪丸中高度表達，位于精子核膜的內膜上，面向頂體，并認為其功能障礙與圓頭精子癥的發(fā)生有關。在Dpy19l2敲除的小鼠精子細胞中，頂體基質不再與頂體緊密結合，頂體無法沿細胞核延伸，最終因頂體形成障礙而導致圓頭精子的形成[24]。Castaneda等[5]研究發(fā)現，序列相似家族209（family with sequence similarity 209，FAM209）在哺乳動物睪丸中特異性表達，是第一個被證明與DPY19L2相互作用的蛋白，定位于內核膜上并對頂體發(fā)育至關重要。在小鼠出生后第20天，睪丸Fam209基因在RNA水平上被檢測到。Fam209-/-小鼠精子活力降低，精子頭部畸形，第9步精子細胞中頂體致密物質異常定位，一些晚期精子細胞中頂體缺失[5]。

纖毛和鞭毛相關蛋白65（cilia and flagella associated protein 65，CFAP65）已被證明定位于人類精子的頂體區(qū)域和鞭毛中段，CFAP65突變會導致嚴重的弱精子癥，表現為頂體發(fā)育不全和鞭毛畸形[25]。Wang等[26]研究發(fā)現，在Cfap65-/-小鼠睪丸中，第9步精子細胞的精子頭部過度狹窄，并伴有精子領（manchette，精子變形過程中短暫出現的特殊裙擺樣結構）結構缺陷和成熟期頂體發(fā)育異常。進一步精子超微結構分析顯示，頂體沿著核周區(qū)異常附著，核周膜中有不規(guī)則腫脹和空泡樣內容物。蛋白質組學分析表明，當CFAP65缺失時，頂體形成過程中的蛋白質平衡系統被破壞，SPACA1在第11～12步精子細胞中顯示異常定位，并且在Cfap65-/-小鼠的成熟精子中不存在；ZPBP在圓形精子細胞中的表達減少，并且未能定位在長形精子細胞的頂體區(qū)域[26]。

頂體下層板（acroplaxome）是核膜和頂體內膜之間的特殊骨架結構，是核周層的一部分。Zhang等[27]研究發(fā)現肌動蛋白相關蛋白T1（actin related protein T1，ACTRT1）在精子頂體下層板特異表達，與ACTRT2、肌動蛋白樣蛋白7A（actin-like protein 7A，ACTL7A）和ACTL9相互作用形成多聚體復合物，并定位于精子細胞的亞染色體區(qū)域，Actrt1-/-雄鼠生育率嚴重降低，精子頭部畸形，頂體下層板結構變得疏松，頂體從核膜上脫落。進一步的蛋白相互作用研究發(fā)現，ACTRT1可能通過與SPACA1、多腺苷二磷酸核糖聚合酶11[poly（ADP－ribose）polymerase 11，PARP11]和精子發(fā)生相關蛋白46（spermatogenesis associated protein 46，SPATA46）相互作用，將發(fā)育中的頂體錨定在細胞核上。

磷酸蛋白質組分析表明，在精子發(fā)育過程中，有幾條依賴于激酶的通路是活躍的，但特定的激酶在精子發(fā)生中的作用尚不清楚[28]。Crapster等[29]研究發(fā)現，同源結構域相互作用蛋白激酶4（homeodomaininteracting protein kinase 4，HIPK4）是精子頂體發(fā)育的重要調節(jié)因子，在小鼠精子形成和發(fā)育中具有重要功能。HIPK4主要表達于圓形和早期伸長的精子細胞中，Hipk4-/-雄鼠不育，表現出與少弱畸形精子癥一致的表型。Hipk4-/-雄鼠精子細胞的頂體與頂體下層板分離，導致頭部結構異常。進一步的研究發(fā)現在培養(yǎng)的成纖維細胞中，HIPK4的過表達誘導分支的絲狀肌動蛋白結構，HIPK4的缺乏改變絲狀肌動蛋白的加帽蛋白在睪丸中的亞細胞分布，因而HIPK4在細胞骨架重塑中具有重要作用[29]。

SPACA1是一種定位于頂體內膜的膜蛋白，對于精子發(fā)生過程中頂體的擴張和避免頂體的退化和消失是必不可少的[30]。Chen等[31]報道了一個SPACA1的純合無義突變，該研究使用蛋白質組學分析和蛋白質相互作用技術證明了SPACA1能夠與ZPBP和ACTL7A相互作用，因而在誘導頂體顆粒附著和將頂體連接到細胞核的過程中具有重要作用。SPACA1的缺失降低了精子中ACTL7A的表達，并削弱了ACTL7A和SPACA1的相互作用，破壞了頂體基質的穩(wěn)定性以及頂體與頂體下層板的對接，最終導致頂體發(fā)育不全。

5 自噬相關蛋白對頂體形成的作用

自噬是真核細胞在自噬相關基因（autophagy related gene，ATG）的調控下，利用溶酶體降解功能失調或不必要的蛋白質和受損細胞器以維持細胞內正常生理活動及穩(wěn)態(tài)的細胞代謝過程[32]。細胞自噬與精子發(fā)生過程中多種生理和病理過程密切相關。Shang等[33]研究發(fā)現自噬缺失會導致精子活力下降，精子尾部結構遭到破壞而出現嚴重的畸形精子癥。Lei等[34]研究顯示，液泡膜蛋白8（vacuole membrane protein 8，Vac8）增強自噬活性，促進精子變形過程中胞質核糖體的自噬降解，從而為長形精子的運動提供能量。

ATG參與了許多與精子命運有關的重要事件，如睪酮等性激素的產生、外質特化結構組裝、頂體發(fā)生和父系線粒體消除等[35]。Atg7-/-雄鼠不育并伴有異常頂體形成，類似于人類圓頭精子癥[36]。特異性敲除雄性生殖細胞中的Atg5會損害自噬流（autophagic flux），導致頂體發(fā)生缺陷、線粒體重排、過多細胞質和殘余體（residual bodies）的保留，因此小鼠的生育力顯著下降。精子超微及結構分析顯示Atg5-/-小鼠附睪尾精子頭部呈圓形、腫脹、彎曲或雙頭畸形，頂體形成異常，精子活力顯著下降[1]。

沉默信息調節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性酶，通過對多種底物進行脫乙酰化而在許多生物過程中起重要作用[37]。SIRT1在細胞核中對微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）的脫乙?；饔檬筁C3重新分布到細胞質，從而介導LC3的核質運輸，這對于自噬小體的形成是必不可少的[38]。Liu等[2]研究發(fā)現，生殖細胞特異性Sirt1-/-雄性小鼠幾乎完全不育，精子頭部形態(tài)異常，頂體結構缺陷，進一步研究表明，在精子發(fā)生過程中，SIRT1通過對LC3去乙?；閷C3的核質運輸，LC3進入細胞質后立即被ATG7激活，然后轉移到高爾基體衍生的小泡中，促進頂體生物發(fā)生。總體而言，自噬相關蛋白影響精子頂體發(fā)生的研究相對較少，分子機制有待于進一步闡明。

6 結語

近年全球男性不育癥的發(fā)病率逐年升高，精子異常是男性不育的主要原因。受精是一個復雜而精細的過程，精子與卵子相遇后，與卵子透明帶上的特異性蛋白相互作用，誘發(fā)頂體反應，與卵子融合最終完成受精過程。作為精子細胞特有的結構，頂體是成功受精的關鍵所在。頂體不同發(fā)育階段受多種不同的蛋白調控，頂體發(fā)育相關蛋白在精子發(fā)生和男性不育癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，頂體結構和功能障礙引起受精失敗而導致男性不育。近年來隨著高通量測序技術和敲除小鼠模型的廣泛應用，已鑒定出許多精子頂體發(fā)育異常相關不育癥致病基因，并揭示了其在精子發(fā)生和不育癥中的重要作用及相關機制，但其精確分子調控機制尚未完全闡明。未來需要更多的研究來證實已發(fā)現的基因是否是人類不育的致病基因，并且對相關蛋白在人類生育中的作用進行有針對性的研究。對頂體發(fā)育相關蛋白在不育癥中作用的深入研究能夠在一定程度上解釋不育癥的發(fā)病機制，為男性不育的診斷和治療提供新的思路。此外，對相關過程的干預將為新型避孕方法的開發(fā)提供依據。