張 瑜， 周文勝綜述， 王 佳審校

高爾基體與神經退行性疾病研究進展

張 瑜1，2， 周文勝1，2綜述， 王 佳3審校

高爾基體是由許多扁平囊泡構成的高度有極性的細胞器，其主要功能是將內質網合成的蛋白質進行加工、分類與包裝，然后分別送到細胞特定的部位或分泌到細胞外。許多研究不僅肯定了高爾基體參與細胞的分泌過程，而且也證實高爾基體具有蛋白糖基化的翻譯后修飾，水解蛋白為活性物質的作用。在神經元內，高爾基體參與了許多內外源性蛋白的順、逆性及突觸膜運輸。因此，高爾基體某一特定或廣泛功能受損，會導致蛋白、脂質轉運異常，甚至神經元生理功能紊亂，從而引起疾病的發(fā)生。神經退行性疾病的病理特點為神經系統(tǒng)特定部位的神經元進行性萎縮或消失。盡管他們具有不同的病因和臨床表現，但大多在組織病理學特征方面有著相似的表現，例如神經元的缺失和膠質細胞的增生、高爾基體形態(tài)的改變以及蛋白質錯誤折疊或異常蛋白的聚集等。高爾基體作為細胞內物質代謝的重要細胞器，其在神經退行性疾病中的作用受到越來越多研究者們的關注。

1.高爾基體碎裂

1.1 高爾基體的形態(tài)和功能 高爾基體(golgi apparatus，GA)，由意大利細胞學家Camillo Golgi于1898年首次用銀染方法在神經細胞中發(fā)現，又稱高爾基復合體或高爾基器。最初電子顯微鏡觀察認為高爾基體由扁平囊泡(cisterna)、小泡(vesicles)和大泡(vacuoles)組成。高爾基體常分布于內質網與細胞膜之間，略呈弓形或半球形，具有一定的極性，扁平囊的凸面靠近細胞核或內質網，稱為生成面(forming face)或未成熟面(mmature face)，與其相反的凹面朝向細胞膜一側，稱為分泌面(secreting face)或成熟面(mature face)。另外，根據膜囊區(qū)的形態(tài)結構、細胞化學反應和執(zhí)行功能，高爾基體可分為3個組成部分[1，2]，即順面高爾基網狀結構(cis golgi network，CGN)、高爾基中間膜囊(medial golgi stack)和反面高爾基網狀結構(trans golgi network，TGN)。其形成部分的不同所產生的作用也各異。

1.2 高爾基體的生理及病理反應 高爾基體是高動態(tài)細胞器，涉及脂質和蛋白質的加工及分類。它形態(tài)的維持依賴于細胞運輸過程及許多蛋白的組成。在不同的生理條件，如細胞有絲分裂、生長或新陳代謝需求等情況下，高爾基體的形態(tài)可發(fā)生改變，而且細胞在有絲分裂過程中高爾基體的改變是可逆的。用諾考達唑或秋水仙堿引起藥物性的微管損傷時，高爾基體同樣發(fā)生可逆性分散或碎裂[3]。然而，在病理條件如內質網功能受損、細胞內運輸途徑的破壞、脂質代謝異常、應激狀態(tài)、DNA損傷以及細胞凋亡途徑的激活等情況下，高爾基體也可發(fā)生改變，而這種改變一般是不可逆的，甚至可加快或引起細胞死亡[4]。

1.3 高爾基體碎裂的相關因素 高爾基體形態(tài)的維持主要依賴3類蛋白質[5](1)微管及微管相關蛋白；(2)高爾基體結構蛋白；(3)高爾基體運輸機制相關蛋白。因此，如高爾基體相關蛋白的受損，將可能導致高爾基體形態(tài)的改變，甚至碎裂。

1.3.1 微管骨架 近30年前就有研究者觀察到運用諾考達唑或秋水仙堿所干預的細胞引起的微管解聚，能夠改變哺乳類動物細胞高爾基體的形態(tài)[6]。研究者們也逐漸認識到除細胞中心體外，許多不同類型細胞中的高爾基體也是微管形成的重要地方，包括海馬神經元和運動神經元[7]。在神經元分化期間，細胞中心體被解散，對微管的形成、軸索的建立和神經元形態(tài)的維持作用甚小。但是，可能因微管的動力學、成核和正確的合成使高爾基體通過擴展和重新排列而不斷增加[8]。

微管是由α、β兩種類型的微管蛋白亞基折疊形成的微管蛋白二聚體。復合體合成的最后過程需5種微管特異伴侶分子輔助而成稱微管結合輔因子(TBCA-TBCE)，它們可以促進微管蛋白的折疊和微管的聚合，其中TBCE在運動神經元中高水平表達，它與順面高爾基體相聯系，對高爾基體來源微管的聚合有著非常大的影響[9]。例如，Bellouze等研究認為，在進行性運動神經病(pmn)的小鼠模型中，因高爾基體中介導微管聚合的TBCE缺失，阻止了COPI衣被小泡的裝配，致使相關栓系蛋白的錯誤定位和高爾基體SNAREs的積累，最終導致高爾基體發(fā)生碎裂[10]。

1.3.2 高爾基體結構蛋白 高爾基體結構蛋白是延長的卷曲螺旋蛋白在高爾基體周圍所形成的蛋白基質，包括P115，GM130，Golgin84和Giantin等，若將它們敲除，高爾基體結構將會發(fā)生改變[11]。除此之外，高爾基體堆疊蛋白65(GRASP65)和高爾基體堆疊蛋白55(GRASP55)兩種非高爾基體結構蛋白，在高爾基體堆到高爾基體條帶，甚至扁平囊泡的管式連接的形成中起著重要作用[12，13]。

有趣地是，有些高爾基體結構蛋白是特異性修飾的目標蛋白，在有絲分裂開始時，高爾基體以可逆的方式發(fā)生生理性碎裂。GM130是順式高爾基體的基質蛋白，它與高爾基體相關結構蛋白相互作用，參與維持高爾基體的結構、控制糖基化、膜泡的運輸。當GM130被磷酸化時，將引起GM130/P115復合體的分解，致使COPI囊泡不再被栓系且不能與目標膜融合，最終導致高爾基體碎裂和有絲分裂簇的形成[12]。此外，GM130、P115和GRASP65是凋亡蛋白酶介導蛋白質水解導致高爾基體碎裂的靶對象[13]。

1.3.3 高爾基體運輸機制相關蛋白 細胞內膜系統(tǒng)各個部分之間的物質傳遞通過膜泡運輸方式進行。膜泡運輸是一種高度有組織的定向運輸，各類運輸泡之所以能夠被準確地運到靶細胞器，主要是因為細胞器的胞質面具有特殊的膜標志蛋白。高爾基體運輸途徑中蛋白的功能涉及從內質網到高爾基體，COPI和COPII衣被復合體，甚至蛋白的栓系、對接和融合機制，這些蛋白的改變，將可能導致典型高爾基體結構的喪失。

膜泡運輸涉及3類衣被蛋白包括網格蛋白、COPI和COPII衣被小泡，各介導不同的運輸途徑。COPI和COPII衣被小泡以出芽的方式各自形成單體后，它們將通過栓系蛋白(P115/GM130)、對接蛋白(Rab蛋白)和融合蛋白(如SNAREs)最終融合到靶細胞器[14]。Wilson等證實，用6羥多巴胺或甲基苯丙胺干預已分化的PC12細胞作為帕金森病(PD)細胞模型分析高爾基體碎裂機制時，認為高爾基碎裂并不是運輸的失衡所引起，而是特異性Rab和SNARE蛋白內環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡的結果，并說明有限數量的Rab和SNARE蛋白內環(huán)境穩(wěn)態(tài)對PD細胞病理學的進一步了解是非常有意義的[15]。總之，囊泡運輸是一個連續(xù)及與其他細胞器相互作用的過程，需高爾基體運輸機制相關蛋白的參與，要求內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的平衡，對高爾基體形態(tài)的維持有著至關重要的作用。

2 高爾基體與神經退行性疾病相關性

2.1 神經退行性疾病中高爾基體形態(tài)的改變 隨著老齡化加劇，神經退行性疾病患病率也節(jié)節(jié)攀升。高爾基體作為重要的細胞器逐漸被關注及研究。在神經退行性疾病神經元中，高爾基體發(fā)生了形態(tài)學改變，如囊狀擴張，斷裂，數目減少，體積變小，與粗面內質網相關聯的囊泡和相鄰的囊泡減少，在核周或胞漿的遠處聚集等。而最典型的改變?yōu)楦郀柣w的完全斷裂[16]。研究發(fā)現，在肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS[17])、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD[18])、帕金森病(Parkinson’s disease，PD[19])、多系統(tǒng)萎縮(multiple system atrophy，MSA[20])等疾病的患者或動物模型的神經元中觀察到高爾基體的碎裂，甚至在其中某些疾病的臨床前階段就可發(fā)現高爾基體的改變。在神經退行性疾病中，神經元高爾基體的碎裂是一個早期的不可逆性損傷，可以導致神經元的死亡[21]。

2.2 神經退行性疾病中高爾基體碎裂的機制 高爾基體碎裂是神經退行性疾病的典型特征，在不同神經退行性疾病中可能涉及不同的機制。許多研究證明，突變的銅鋅超氧化物歧化酶(Mutation of Superoxide dismutase1，mSOD1)，β-淀粉樣蛋白(amyloid β-peptide，Aβ)，alpha-synuclein，Stathmin及Tau蛋白等均與高爾基體碎裂及神經元退變有關。下面主要從神經退行性疾病中蛋白錯誤折疊以及突變基因產物或者蛋白的異常聚集方面所引起的高爾基體碎裂的有關研究作一概述。

2.2.1 ALS與突變SOD1 ALS是以上、下運動神經元進行性丟失為特征的一種神經退行性疾病，以肌無力、肌萎縮、肌束震顫，延髓麻痹和錐體束征等為主要臨床表現。有文獻指出，約50% ALS患者在3 y內因呼吸衰竭死亡[22]。絕大多數的ALS病例為散發(fā)性ALS(SALS)，無明確家族遺傳史；只有少數約5%～10%的ALS病例為家族性ALS(FALS)[23]。

1993年Rosen提出FALS的發(fā)病與SOD1基因突變有關[24]。Gurney等將人突變SOD1基因轉移至實驗鼠，這些轉基因鼠在3～4 m開始出現類似人類ALS的臨床癥狀，并在隨后的1 m內死亡，病理檢查顯示脊髓運動神經元出現大范圍缺失，與人類ALS病理特征相似，進一步研究認為ALS運動神經元的損傷與SOD1基因突變有關[25]。其中，約20% 的FALS 和5% 的SALS 與SOD1基因突變有關[26]。

SOD1基因位于21q22，長11 kb，編碼區(qū)459 bp，5個外顯子，編碼153個氨基酸，組成32 kD的Cu/Zn SOD蛋白，分布于細胞胞漿內。SOD1是一種抗氧化酶，能催化O2轉化為H2O2，維持細胞內活性氧內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，以達到解毒的目的。有研究發(fā)現，在SALS和FALS患者身上發(fā)現的不可溶性蛋白的聚集是免疫反應性的SOD1，它的錯誤折疊和蛋白聚集與ALS密切相關[27]。突變后的SOD1基因會產生過量的自由基，對運動神經元產生毒性作用，甚至發(fā)生聚集形成高分子量的不可溶性復合物，最終導致運動神經元死亡[28]。

許多研究報道，在SALS患者的前角細胞[29]中可見高爾基體碎裂，而且在含有嗜堿性包涵體的ALS青年[30]、后柱受累的FALS患者[17]、SOD1G93A轉基因小鼠模型的脊髓運動神經元中[3]同樣可見高爾基體碎裂。另外，有研究認為，在轉基因SOD1G93A鼠模型中，高爾基體碎裂是ALS病理學的一個早期事件，與細胞內運輸組織的改變有關[10]。近年來Atkin等證明，與ALS相關的3個不同的突變基因包括SOD1，TDP-43，FUS。在轉基因表達人SOD1G93A老鼠模型中，ALS相關的突變的SOD1主要定位于細胞質中，它通過抑制蛋白從內質網到高爾基體的運輸使早期分泌途徑受損，引起內質網應激，高爾基體碎裂，最終導致細胞凋亡[31]。由此可知，ALS中突變的SOD1所產生的影響可能使分泌途徑內質網到高爾基體運輸鏈的受損，可能是引起ALS疾病發(fā)生的上游因素和觸發(fā)疾病的主要因素。另外，Bellouze等表明，在轉基因突變的SOD1G85R和SOD1G93A老鼠模型中，嚴重的高爾基碎裂與高爾基體來源的微管聚合的不足、COPI衣被小泡的亞族β-COP的丟失、高爾基體栓系蛋白GM130胞質中的分散和ER-Golgi v-SNAREs GS15、GS28的大量積累相關，并證實在ALS相關的突變SOD1運動神經元中，Stathmin1/2所觸發(fā)的微管的損失介導高爾基碎裂[3]。

2.2.2 AD與Aβ、Tau AD是老年人常見的一種以進行性癡呆為主要特征的神經元退行性疾病。其病理特征為患者大腦皮質和海馬區(qū)出現大量老年斑(enile plaques，SP)、細胞內的神經原纖維纏結(eurofibrillary tangles，NFTs)和神經元缺失伴膠質細胞增生等。其中SP和NFT是AD兩個典型的特征性病理改變。臨床表現為進行性記憶、認知功能障礙和性格、行為的改變，甚至判斷力、認知力完全喪失，生活不能自理等。

AD的典型病理特征之一為大量SP的形成，主要由Aβ積累所引起。腦內Aβ是由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)經β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而產生的含有39-43個氨基酸的多肽。APP作為一種跨膜蛋白，在體內各種組織廣泛存在，而在腦中表達量最高。APP和其分泌酶的運輸、形成、分類及加工進程等需高爾基體的正常運行。APP的運輸途徑從內質網到高爾基體，然后到質膜。例如，APP的形成過程能產生Aβ，可能發(fā)生在高爾基體和分泌途徑晚期，若高爾基體運輸功能受損，可能會影響APP的正常運輸。

有文獻指出，Aβ的大量積累可導致AD的發(fā)生，但是若降低其在大腦的表達量，能夠延緩或減輕AD的癥狀，并認為Aβ可能是導致AD病因中的共同通路，在AD的形成中起著重要的作用[32]。Joshi等研究證明，在組織培養(yǎng)和AD模型鼠中，Aβ的積累引起GRASP65發(fā)生磷酸化，可能是導致高爾基體碎裂的主要原因[33]。在分子水平，Aβ的積累可引起Ca2+內流[34]，其可激活鈣蛋白酶，鈣蛋白酶可增加P25-P35的裂解[35]，其中P25能夠激活cdk5。P35和cdk5與高爾基體膜和其膜的運輸的調節(jié)相關[36]。激活的Cdk5可使GRASP65發(fā)生磷酸化，最終導致高爾基體碎裂[33]。反過來，當高爾基體發(fā)生碎裂時，其能夠影響APP及其酶的運輸，增加Aβ的產生。更重要的是，高爾基體的缺陷可影響重要神經蛋白的加工及運輸進程，使神經功能受累，如此形成惡性循環(huán)加速疾病的發(fā)展。假設若挽救高爾基體的結構及功能，可減慢APP的運輸及減少Aβ的生成，從而延緩AD的發(fā)展[37]。目前，臨床對AD的治療尚缺乏有效的治愈方法，而高爾基體與Aβ及APP存在著千絲萬縷的聯系，渴望高爾基體碎裂在AD中有更深入的研究，能確切的做到挽救碎裂的高爾基體，甚至研發(fā)出相應的藥物治療靶點，早日應用于臨床。

AD的典型病理特征之二為NFTs的形成，其主要成分為過度磷酸化的tau蛋白。Tau蛋白是神經元含量最高的一種微管相關蛋白，其主要功能是促進微管合成及穩(wěn)定微管，起到維持細胞骨架的作用，并作為通路使細胞器、囊泡、蛋白質和信號分子在胞內運輸，多數定位于神經元軸突內[38]。當Tau蛋白發(fā)生病變時，可溶性Tau蛋白裝配成不可溶性單體纖維，最終導致神經元退行性變。在AD患者，異常過度磷酸化的Tau蛋白以配對螺旋結構形成NFTs在神經元中聚積，對神經元的蛋白結構、分布和功能帶來不利影響。在AD的不同階段，Tau蛋白均起著至關重要的作用。研究表明，在神經退行性變的早期，即可出現Tau蛋白異常磷酸化，導致突觸缺失、軸突運輸受損和神經炎的發(fā)生。Stieber等認為，在早期階段的AD患者神經元中就可觀察到高爾基體形態(tài)的改變，其主要集中在海馬區(qū)域，額、顳、頂葉皮質神經元中也占小部分比例[39]。在AD患者中可觀察到的典型現象為過度磷酸化的Tau蛋白可誘導高爾基體碎裂，這種現象可出現在NFTs之前[40]。

Wang等研究表示，在4 m、8 m、13 m、16 m的C57BL/6的鼠的大腦中觀察到高爾基體碎裂的增加是年齡相關的，并與Tau蛋白的過度磷酸化相關聯。同時，Golgin84和GRASP65作為高爾基體相關蛋白，在年齡大的鼠的大腦中可見兩者水平減少，進一步研究發(fā)現，在HEK293/tau細胞中，過表達golgin-84能挽救布雷非德菌素A所誘導的高爾基體碎裂和Tau蛋白的過度磷酸化。證實，通過激活cdk5和細胞外信號調節(jié)激酶，golgin-84相關的高爾基體碎裂觸發(fā)Tau蛋白的高度磷酸化，并認為高爾基體碎裂是觸發(fā)Tau蛋白磷酸化的上游因素[41]。值得關注的是，Liazoghli等研究證實，在初級海馬神經元中，過表達野生型和突變的人源型Tau蛋白(P301L、V337M、R406W)時可誘導高爾基碎裂，提示Tau蛋白的過量堆積、NFTs的形成可能先于高爾基體形態(tài)的改變[40]。

另外，Farah等認為在高爾基體膜上可觀察到Tau蛋白，它與高爾基體膜相互作用，介導Tau蛋白、高爾基體與微管相聯系。在轉染Tau蛋白的SH-SY5Y細胞中，Tau蛋白與微管結合，增強微管的穩(wěn)定性，甚至有的可誘導微管成束，其成束可能是受Tau蛋白影響[42]。若Tau蛋白異常過度磷酸化，會破壞其與微管的結合能力，限制微管的組合，從而使其聚集成NFTs，引起微管解體，并最終導致軸突微管的運輸功能受損[43]。據報道，在老鼠中共表達人源型短縮和完整長度的Tau蛋白可導致可溶性高分子量Tau蛋白的形成、軸突運輸的受損、線粒體的聚集、高爾基體的損傷和突觸蛋白的錯誤分配[44]。

Tau蛋白的沉積和NFT的形成可造微管網的損傷。微管的不足可能影響高爾基體在細胞的中心定位和內質網到高爾基再到質膜的運輸，其將直接影響高爾基體的形態(tài)及大小。因此，在AD中，高爾基體的形態(tài)和功能、微管組織與Tau蛋白病理密切相關。

3 展 望

高爾基體在蛋白的運輸和分類中扮演著重要的角色，對神經細胞的功能起著關鍵作用。在許多神經退行性疾病中高爾基體發(fā)生碎裂，提示高爾基體的不足可能促進神經元退行性變。高爾基體碎裂涉及許多不同的機制，但是其在神經退行性疾病中的具體機制，目前尚不完善。如當高爾基體發(fā)生碎裂時，如何有效的挽救高爾基體，如何減少或抑制異常蛋白的積累等，從而改善神經功能的缺損，延緩神經退行性疾病的發(fā)展？希望越來越多的研究者去探究高爾基體在神經退行性疾病中的作用，為臨床提供藥物治療靶點，減輕神經退行性疾病給患者帶來的痛苦，降低其致殘率和致死率。

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2017-01-15；

2017-03-05

湖南省自然科學基金(14JJ2143)；湖南省衛(wèi)計委科研項目(B2013-065；B2012-121) 作者單位：(1.湖南省人民醫(yī)院神經內科，湖南 長沙 410016；2.南華大學湖南省人民醫(yī)院神經內科，湖南 長沙 410016；3.湖南省人民醫(yī)院湖南省老年醫(yī)學研究所，湖南 長沙 410016)

周文勝，E-mail：zhouwensheng2004@163.com；王 佳，E-mail：13875888342@163.com

1003-2754(2017)05-0474-04

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