常超越 ， 張召興 ， 閆艷娟 ， 賈青輝 ， 李蘊(yùn)玉 ， 張香齋 ， 李佩國

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 河北 秦皇島 066604)

2016年9月，秦皇島市大蒲河鎮(zhèn)某養(yǎng)雞場，24日齡的雛雞出現(xiàn)了扎堆，進(jìn)而大群采食量下降，排黃、白、綠色稀便，肛門周圍有糞便污染，鼻腔周圍偶有泡沫樣分泌物，每天死亡20只左右。對(duì)病死雞進(jìn)行了剖檢，無菌采集病料組織分離了2種病原菌，并命名為QHE-1和QHS-1，通過鑒定，分離株QHE-1、QHS-1分別鑒定為大腸桿菌、沙門菌。對(duì)其分離的2株菌進(jìn)行了耐藥性分析，以便為該地區(qū)大腸桿菌與沙門菌混合感染引起雛雞腹瀉的防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 對(duì)秦皇島市大蒲河鎮(zhèn)某養(yǎng)雞場死亡的雛雞進(jìn)行剖檢，無菌采集具有典型病理變化的肝臟、心血、腎臟等病料組織。

1.2 主要試劑 普通瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；美藍(lán)染色液試劑盒，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；微量發(fā)酵管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；ID32E腸道菌鑒定試條，購自法國梅里埃公司；DL-2 000 Marker、2×TaqMarker Mix、樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒，均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；7%綿羊脫纖血液瓊脂培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室自制，常規(guī)的試劑及儀器有本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 細(xì)菌分離 將無菌采集的病死雞的肝臟、心血、腎臟等病料組織，劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h，選取優(yōu)勢(shì)生長菌分別接種于S.S.瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h。通過鑒別培養(yǎng)后，分別接種于普通培養(yǎng)基純化培養(yǎng)后，挑取純化培養(yǎng)后優(yōu)勢(shì)菌落接種在營養(yǎng)肉湯中200 r/min 37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)，并革蘭染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.4 生化鑒定 按鑒定試劑條說明書進(jìn)行操作，用自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化試驗(yàn)。

1.5 細(xì)菌基因組DNA的提取及16S rRNA PCR的擴(kuò)增與測(cè)序 用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)的菌液，按照樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行提取基因組DNA，16S rRNA基因組DNA通用引物，P1 5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′，P2 5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，以提取的基因組DNA為模板，經(jīng)行PCR反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄基因序列進(jìn)行同源性比較分析。

1.6 致病性試驗(yàn) 將24日齡雛雞分為3組，每組4只，第1、2組為試驗(yàn)組，每只雛雞分別腹腔注射分離菌株QHE-1和QHS-1，劑量為0.25 mL(108CFU/mL)；第3組接種等量的營養(yǎng)肉湯作為陰性對(duì)照。接種12 h后，觀察7 d，記錄發(fā)病及死亡情況，對(duì)于死亡的雛雞剖檢，進(jìn)行分離鑒定

1.7 紙片法藥敏試驗(yàn) 按照美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷。

2 結(jié)果

2.1 病理變化 剖檢可見嗉囊流出有酸臭味的內(nèi)容物，氣管壁粘有白色黏液，心包有黃色膠胨樣滲出，腺胃彌漫性出血，肝臟腫大發(fā)黃伴有纖維素性滲出，十二指腸片狀出血。發(fā)病時(shí)間較長者可見腎臟腫大。

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)特性和形態(tài)特征 從送檢病死雞的肝臟、心血、腎臟等病料組織中分離到2種優(yōu)勢(shì)菌落，在血液瓊脂培養(yǎng)基分別呈灰白色、表面光滑中等大小和粉紅色、圓形隆起、光滑濕潤、邊緣整齊的菌落。分離菌株QHE-1在麥康凱培養(yǎng)基可見邊緣光滑整齊、濕潤的、扁圓型、粉紅色菌落及邊緣整齊的小菌落；分離菌株QHS-1在S.S.瓊脂培養(yǎng)基可見無色半透明菌落,部分菌落中間帶黑色。革蘭染色QHE-1呈兩端鈍圓革蘭陰性桿狀菌，QHS-1中等大小、兩端略圓的直桿狀革蘭陰性菌。與報(bào)道大腸桿菌和沙門菌培養(yǎng)特性和形態(tài)特征一致。

2.3 細(xì)菌生化特性鑒定 分離菌株QHE-1能分解鼠李糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇；木糖和阿拉伯糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，吲哚和甲基紅反應(yīng)成陽性，V-P試驗(yàn)呈陰性，經(jīng)ATB自動(dòng)生化儀鑒定為大腸桿菌，評(píng)定結(jié)果合格率為 99.5%。分離菌株QHS-1能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、枸櫞酸鹽; 不發(fā)酵乳糖、蔗糖、尿素；吲哚試驗(yàn)呈陰性，產(chǎn)生H2S，經(jīng)ATB自動(dòng)生化儀鑒定為沙門菌，評(píng)定結(jié)果合格率為 98.5%。

2.4 細(xì)菌基因組DNA的提取及16S rRNA PCR的擴(kuò)增與測(cè)序 用16S rRNA的通用引物對(duì)分離菌株QHE-1和QHS-1進(jìn)行了PCR 鑒定，均擴(kuò)增出大約為1 492 bp左右的的目的條帶(見圖1)。與GenBank DNA序列數(shù)據(jù)庫中基因序列進(jìn)行比對(duì)，分離菌株QHE-1與大腸桿菌的參考株同源性為99.9%，分離菌株QHS-1與沙門菌參考株同源性為99.6%。

圖1 分離菌株QHE-1和QHS-116S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.5 致病性試驗(yàn) 試驗(yàn)組雛雞在攻毒12 h后逐漸出現(xiàn)死亡，其中，QHE-1攻毒組死亡率100%(4/4)，QHS-1攻毒組死亡率75%(3/4)，剖檢后進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果顯示，所分離菌株與QHE-1和QHS-1一致。對(duì)照組4只雛雞健康存活，表明分離菌株QHE-1和QHS-1對(duì)雛雞均具有一定致病性。

2.6 耐藥性分析 由表1可知，分離菌株QHE-1和QHS-1均對(duì)阿米卡星、頭孢克肟、頭孢曲松3種藥物敏感， QHE-1株對(duì)恩諾沙星、大觀霉素、氟苯尼考3種藥物中敏；對(duì)其他存在耐藥； QHS-1株對(duì)恩諾沙星、林可霉素、氟苯尼考3種藥物中敏；對(duì)其他存在耐藥。

表1 分離菌株QHE-1和QHS-1藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：S: 敏感; I: 中敏; R: 耐藥