馬天文 ， 王冠穎 ， 李 玥 ， 李欣然 ， 姜仁禮 ， 宋霄鵬 ，張志恒 ， 白 薈 ， 李 新 ， 陳宇航 , 高 利

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)窒 ， 黑龍江 哈爾濱 150030；2.通遼市魯北鎮(zhèn)獸醫(yī)站， 內(nèi)蒙古 通遼 029100)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種慢性、漸進(jìn)性、退行性膝關(guān)節(jié)疾病，是世界上導(dǎo)致殘疾的主要疾病之一，主要涉及軟骨、關(guān)節(jié)滑膜及軟骨下骨，以關(guān)節(jié)周?chē)弁醇瓣P(guān)節(jié)功能障礙為主要臨床表現(xiàn)[1]。促進(jìn)馬OA發(fā)病的因素很多，其中正常的關(guān)節(jié)受到異常力的作用和異常的關(guān)節(jié)受到正常力的作用是主要影響的因素。目前OA 診斷主要依據(jù)臨床癥狀和影像學(xué)方法，但早期OA患畜的確診情況并不理想。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者也致力于發(fā)現(xiàn)一些能夠早期診斷并區(qū)分OA嚴(yán)重程度的相關(guān)生物學(xué)標(biāo)記物(biomarker, BM)，通過(guò)對(duì)BM的研究與臨床應(yīng)用，希望可以在影像學(xué)改變出現(xiàn)前，對(duì)OA進(jìn)行早期診斷，并且預(yù)測(cè)組織結(jié)構(gòu)破壞發(fā)生的可能性及疾病進(jìn)展，同時(shí)評(píng)估治療效果[2]。

II型膠原羧基端端肽(C-telopeptide-of-CⅡ, CTX-II)是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)降解II型膠原的產(chǎn)物，為Ⅱ型膠原1/4片段的羧基端端肽，相對(duì)分子質(zhì)量較小，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨破壞危險(xiǎn)性的評(píng)估具有特異性[3]。CTX-II作為惟一可同時(shí)在血液、尿液和滑液中檢測(cè)的標(biāo)志物，其樣品穩(wěn)定性高，對(duì)常規(guī)臨床檢測(cè)更有意義，因此逐漸成為BM研究的熱點(diǎn)[4]。本研究采用酶聯(lián)免疫夾心法(Sandwich-ELISA)測(cè)定馬骨關(guān)節(jié)模型關(guān)節(jié)液中不同時(shí)間點(diǎn)的CTX-II水平，探索CTX-II濃度與OA 發(fā)病程度的關(guān)系，為以后建立馬OA的快速診斷技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用13匹蒙古馬，年齡5～8歲，體重331～511 kg，購(gòu)自黑龍江省肇東市某養(yǎng)殖場(chǎng)。在進(jìn)入研究之前，所有馬進(jìn)行臨床檢查，腕關(guān)節(jié)攝影，跛行檢查，對(duì)腕關(guān)節(jié)屈曲反應(yīng)和滑膜積液的評(píng)估，以確保所有測(cè)量的變量都在正常參考范圍內(nèi)。并且每匹馬分別進(jìn)行體況評(píng)分[6]，得分均在4～6分之間。為了適應(yīng)環(huán)境，在試驗(yàn)前兩周，將馬拴養(yǎng)在固定的馬圈中，隨意采食飼料，每日放馬1次。

1.2 試劑 鹽酸美沙酮、鹽酸地托咪定、磷酸鹽緩沖液(PBS)，均購(gòu)自Sigma公司；馬CTX-II成品ELISA試劑盒，購(gòu)自Shsaimo公司；兩性霉素，購(gòu)自Amresco公司。

1.3 誘導(dǎo)OA模型 將13匹蒙古馬隨機(jī)分為兩組，試驗(yàn)組8匹，造模組5匹。臨床檢查都在正常參考范圍內(nèi)，體況檢測(cè)合格。用PBS將兩性霉素B稀釋為25 mg/mL。試驗(yàn)開(kāi)始前，給馬靜脈注射鹽酸美沙酮(0.1 mg/kg體重)和鹽酸地托咪定(0.1μg/kg體重)，進(jìn)行鎮(zhèn)靜。造模組在馬左側(cè)腕關(guān)節(jié)內(nèi)注入2 mL無(wú)菌的兩性霉素B稀釋液，誘導(dǎo)馬OA模型。對(duì)照組關(guān)節(jié)腔注入2 mL無(wú)菌的PBS。

1.4 樣品采集及處理 在兩性霉素B給藥之前，收集所有馬左側(cè)腕關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)滑液0.5～1 mL。在整個(gè)研究期間每周收集0.5-1 mL滑液樣品，直到第9周。將樣品收集在沒(méi)有任何添加劑的EP管中。收集的關(guān)節(jié)液1 h內(nèi)離心15 min(10 000 r/min)，收集上清液，-80 ℃保存待用。從0周到9周每周次分別采用ELISA試劑盒測(cè)定造模組和對(duì)照組馬關(guān)節(jié)滑液中CTX-II含量，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒商家說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 臨床指標(biāo)的監(jiān)測(cè) 每次收集關(guān)節(jié)滑液后，記錄馬的直腸溫度，呼吸頻率，脈搏和腕關(guān)節(jié)周長(zhǎng)，并且進(jìn)行馬跛行評(píng)估，標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)馬獸醫(yī)協(xié)會(huì)(AAEP)制定的跛行分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行評(píng)分。0級(jí)：健康狀態(tài)；1級(jí)：不易發(fā)現(xiàn)跛行和行走障礙，間斷性的跛行出現(xiàn)在特定的情況(如負(fù)重、轉(zhuǎn)圈、斜面和硬地面)；2級(jí)：不易發(fā)現(xiàn)跛行，但行走異常。持續(xù)性跛行出現(xiàn)在特定的情況(如負(fù)重、轉(zhuǎn)圈、斜面和硬地面)；3級(jí)：在任何情況下，都出現(xiàn)明顯的跛行；4級(jí)：明顯的跛行，并且伴隨行走點(diǎn)頭和步幅縮小；5級(jí)：明顯的跛行，在最小的負(fù)重量的情況下，不愿移動(dòng)或站立。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Social Sciences 19.0(SPSS Inc. USA)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表示為MEAN±SD表示，使用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。以P<0.05為差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀 兩性霉素B注射后，造模組和對(duì)照組馬的直腸溫度、呼吸、脈搏都在正常的范圍內(nèi)。對(duì)照組的馬在試驗(yàn)期間沒(méi)有出現(xiàn)跛行癥狀，造模組的馬在建立OA模型后的第1、2周表現(xiàn)出1級(jí)跛行，在第3、4、5周表現(xiàn)出2級(jí)跛行，在第6、7、8 周表現(xiàn)出3級(jí)跛行，在第9周表現(xiàn)出5級(jí)跛行。對(duì)照組的馬關(guān)節(jié)周長(zhǎng)平均為28.6 cm，在試驗(yàn)期間沒(méi)有明顯變化。造模組馬的關(guān)節(jié)周長(zhǎng)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，第2周開(kāi)始差異顯著(P<0.05)，第3周至第9周差異極顯著(P<0.01)(見(jiàn)圖1)。

2.2 關(guān)節(jié)液CTX-II含量變化 如圖2所示，與對(duì)照組相比，造模組從第1周開(kāi)始，關(guān)節(jié)液中CTX-II的含量增加，之后第2周開(kāi)始顯著增加(P<0.05)，第4周開(kāi)始呈極顯著增加(P<0.01)并且保持增加的趨勢(shì)直到第9周。

圖2 馬關(guān)節(jié)液CTX-II濃度(ng/mL)變化

*：差異性顯著(P< 0.05)；**：差異性極顯著(P< 0.01)

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨是由軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)構(gòu)成的一種無(wú)血管、神經(jīng)、淋巴組織分布的結(jié)締組織。ECM主要包括膠原和蛋白多糖兩種物質(zhì)，II型膠原是構(gòu)成基質(zhì)的主要成分，也是維持基質(zhì)穩(wěn)定的重要成分[6]。因此，II型膠原作為最重要的軟骨成分之一，其代謝產(chǎn)物水平成為監(jiān)測(cè)軟骨病理生理的改變研究的熱點(diǎn)之一。CTX-II是一種II型膠原的降解產(chǎn)物，1987年Eyre等[7]在牛關(guān)節(jié)軟骨研究中首次發(fā)現(xiàn)，為共價(jià)鍵組成的三螺旋片段，可在組織蛋白酶作用下產(chǎn)生小分子多肽。CTX-II完全來(lái)自成熟的結(jié)構(gòu)膠原，并以小肽形式全部進(jìn)入尿液[8]。Lohmander L S等[9]報(bào)道在關(guān)節(jié)損傷或OA發(fā)病后1周，關(guān)節(jié)液中CTX-II的含量就有明顯的升高，最后逐漸下降到一個(gè)穩(wěn)定的水平，而且在影像學(xué)發(fā)生病變的OA病例以及影像學(xué)未發(fā)現(xiàn)的早期OA病例，關(guān)節(jié)液中CTX-II的含量都有顯著升高，其中影像學(xué)未發(fā)現(xiàn)的早期OA病例相比對(duì)照組升高3倍。Jonathan等[10]也報(bào)道在急性關(guān)節(jié)損傷后，關(guān)節(jié)液中CTX-II的含量有顯著的升高。

馬關(guān)節(jié)內(nèi)注射兩性霉素B建立OA模型同手術(shù)方法誘導(dǎo)OA模型相比，是具有快速、安全、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)避免了手術(shù)創(chuàng)口對(duì)試驗(yàn)的影響[11]。有研究表明，用此種方法成功誘導(dǎo)建立牛和驢的骨關(guān)節(jié)炎模型[12]。兩性霉素B引起馬跛行可能是由于其對(duì)軟骨基質(zhì)和滑膜的毒性作用引起炎癥反應(yīng)以及滑液分泌增多所導(dǎo)致的。OA以往的研究是采用影像學(xué)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)馬匹的病情程度進(jìn)行評(píng)定[3]，然而影像學(xué)的改變并不能直觀準(zhǔn)確的反映軟骨的病變程度，存在一定的誤差，另外以往的研究中所檢測(cè)的樣本為病畜的血液或尿液[13]，這兩種樣本更大程度上反映的是全身性的代謝情況，并不能準(zhǔn)確的反映局部關(guān)節(jié)軟骨的病變程度，這些都有可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響。所以本研究通過(guò)檢測(cè)膝關(guān)節(jié)液中II型膠原分解代謝產(chǎn)物中CTX-II含量，直接準(zhǔn)確的探討關(guān)節(jié)液中CTX-II濃度與關(guān)節(jié)軟骨病變程度間的關(guān)系。在關(guān)于人OA的研究中發(fā)現(xiàn)，與正常關(guān)節(jié)相比，患病關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)液中CTX-II的量明顯增加，而且濃度的增加程度與損傷程度有關(guān)[14]。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組關(guān)節(jié)液內(nèi)CTX-II濃度無(wú)明顯變化，造模組馬關(guān)節(jié)液CTX-II濃度在注射兩性霉素B后第2周開(kāi)始顯著增加(P<0.05)，在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中關(guān)節(jié)液CTX-II濃度持續(xù)升高直至第9周試驗(yàn)結(jié)束。造模組在腕關(guān)節(jié)注入兩性霉素B后第3周開(kāi)始出現(xiàn)不同程度跛行，并且CTX-II濃度的升高在跛行前就已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的顯著性升高，這一結(jié)果與人OA病變過(guò)程中CTX-II變化趨勢(shì)相符[14]。本試驗(yàn)結(jié)果早期濃度的顯著性升高證明了軟骨的降解早于臨床癥狀的出現(xiàn)。CTX-II濃度的升高意味著II型膠原的降解，使ECM遭到破壞從而加重OA程度。

綜上所述，推測(cè)關(guān)節(jié)滑液中的CTX-II可以作為潛在的馬早期骨關(guān)節(jié)炎診斷的BM，為以后建立馬骨關(guān)節(jié)炎的快速臨床診斷技術(shù)提供理論依據(jù)。

[1] Hani A F, Kumar D, Malik A S,etal. Fusion of multinuclear magnetic resonance images of knee for the assessment of articular cartilage[J]. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc, 2013, 2013(7): 6 466-6 469.

[2] Atherton H J, Jones O A, Malik S,etal. A comparative metabolomic study of NHR-49 in Caenorhabditis elegans and PPAR-alpha in the mouse[J]. FEBS letters, 2008, 582(12): 1 661-1 666.

[3] Mokbel A N, Tookhy O S E, Shamaa A A,etal. Homing and reparative effect of intra-articular injection of autologus mesenchymal stem cells in osteoarthritic animal model[J]. Bmc Musculoskeletal Disorders, 2011, 12(1): 259.

[4] Dam E B, Loog M, Christiansen C,etal. Identification of progressors in osteoarthritis by combining biochemical and MRI-based markers[J]. Arthritis Research & Therapy, 2009, 11(4): R115.

[5] Ross M, Dyson S, Ross M,etal. Diagnosis and management of lameness in the horse[M]. Oxford, Elsevier LTD, 2011: 247-267.

[6] Cui N, Hu M, Khalil R A. Biochemical and Biological Attributes of Matrix Metalloproteinases[J]. Progress in Molecular Biology & Translational Science, 2017, 147: 1.

[7] Eyre D R, Apon S, Wu J J,etal. Collagen type IX: Evidence for covalent linkages to type II collagen in cartilage[J]. Febs Letters, 1987, 220(2): 337-341.

[8] Jch R, Garnero P. Biological markers in osteoarthritis[J]. Bone, 2007, 3(6): 346-356.

[9] Lohmander L S, Atley L M, Pietka T A,etal. The release of crosslinked peptides from type II collagen into human synovial fluid is increased soon after joint injury and in osteoarthritis[J].Arthritis & Rheumatology, 2003, 48(11): 3 130-3 139.

[10] Catterall J B, Stabler T V, Flannery C R,etal. Changes in serum and synovial fluid biomarkers after acute injury (NCT00332254)[J]. Arthritis Research & Therapy, 2010, 12(6): R229.

[11] Kotschwar J L, Coetzee J F, Anderson D E,etal. Analgesic efficacy of sodium salicylate in an amphotericin B-induced bovine synovitis-arthritis model[J]. Journal of Dairy Science, 2009, 92(8): 3 731-3 743.

[12] Reijman M, Hazes J M, Bierma-Zeinstra S M,etal. A new marker for osteoarthritis: Cross-sectional and longitudinal approach[J]. Arthritis & Rheumatology, 2004, 50(8): 2 471-2 478.

[13] Sharif M, Kirwan J, Charni N,etal. A 5-yr longitudinal study of type IIA collagen synthesis and total type II collagen degradation in patients with knee osteoarthritis-association with disease progression[J]. Rheumatology, 2007, 46(6): 938.

[14] Jiang Q, Qiu Y, Chen M,etal. Synovial TGF-β1 and MMP-3 levels and their correlation with the progression of temporomandibular joint osteoarthritis combined with disc displacement: A preliminary study[J]. 2013, 1(2): 218-222.