黃翠琴 ， 楊守深 ， 梁齊章 ， 王正磊 ， 楊小燕 ， 吳德峰 ， 尹會方

(1. 龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 ， 福建 龍巖 364012 ； 2.福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室 ， 福建 龍巖 364012 ；3.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 ， 福建 福州 350002)

華南虎是我國特有的虎亞種，目前野外幾乎滅絕。梅花山中國虎園景區(qū)位于福建省龍巖市上杭縣步云鄉(xiāng)，是我國重要的華南虎拯救工程基地。由于華南虎在生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的地位，因此，對華南虎致病菌及其耐藥性的研究，對該物種的保護(hù)和繁育具有重要意義。大腸桿菌是一類廣泛存在于自然界，能引起人和動物共同感染的重要人獸共患病，常常與其他病原菌混合感染，發(fā)病率和死亡率較高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

目前對該地區(qū)虎源大腸桿菌耐藥性和致病性缺乏相應(yīng)的參考資料，因此，本研究通過無菌采集龍巖梅花山虎園老虎的糞便，進(jìn)行大腸桿菌的分離鑒定、藥敏試驗、動物毒力試驗以及毒力基因檢測。通過研究獲得其致病性及耐藥情況，為龍巖梅花山地區(qū)虎源致病性大腸桿菌病的防控和臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 2015年采集龍巖梅花山華南虎園4只健康母虎新鮮糞便分離大腸桿菌，經(jīng)分離純化得到的4株大腸桿菌，本次取樣母虎未使用任何藥物。試驗小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司；麥康凱培養(yǎng)基、LB肉湯、MH肉湯、MH瓊脂和伊紅美藍(lán)瓊脂，均購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 細(xì)菌分離鑒定 采用無菌棉簽采集母虎的新鮮糞便，接種于LB肉湯培養(yǎng)基，并置于37 ℃的恒溫?fù)u床(200 r/min)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～6 h。用接種環(huán)取少量培養(yǎng)液均勻劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基中，37 ℃的恒溫培養(yǎng)16～24 h。挑選疑似菌落進(jìn)一步純化，并通過革蘭染色后鏡檢和16S rRNA(F：5′-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3′，R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[1]。

1.3 藥敏試驗 大腸桿菌的藥物敏感性測定按照CLSI(2010)推薦方法執(zhí)行[2]。大腸桿菌ATCC 25922作為藥敏質(zhì)控菌。

1.4 動物試驗 試驗小鼠10只，隨機(jī)分為試驗組A、B、C、D和對照組E，每組2只。試驗組腹腔接種LB菌液，每只0.5 mL；對照組腹腔接種相同劑量的空白LB液體培養(yǎng)基，隔離飼養(yǎng)。觀察發(fā)病及死亡情況。

1.5 毒力基因的檢測 采用水煮法提取細(xì)菌基因組DNA作為PCR模板，分別對8種毒力基因進(jìn)行PCR檢測。8對引物毒力基因引物序列及目的片段長度參考文獻(xiàn)報道[3]，見表1。

表1 毒力基因引物序列及片段長度

F：上游引物； R：下游引物

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離和鑒定 從龍巖梅花山虎園中采集4份母虎糞便，經(jīng)分離純化得到的4株大腸桿菌。細(xì)菌在麥康凱培養(yǎng)基中，呈粉色、圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明、小凸起；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基中，菌落中心呈黑色，有金屬光澤。革蘭染色結(jié)果鏡檢觀察可見兩端頓圓、呈短桿狀、紅色的革蘭陰性菌。經(jīng)16S rRNA 鑒定，可得到目的條帶，確定分離株菌為大腸桿菌。

2.2 藥敏試驗結(jié)果 根據(jù)紙片法抗菌藥物敏感試驗方法，其結(jié)果見表2。分離株對復(fù)方新諾明的耐藥率最高為100%；對多西環(huán)素和阿莫西林/克拉維酸耐藥率均為75%；對恩諾沙星和左氧氟沙星的耐藥率為50%。對慶大霉素的敏感性最好；對頭孢呋辛和頭孢噻呋敏感性下降。

表2 藥敏試驗結(jié)果

R：耐藥 ； I：中介 ； S：敏感

2.3 動物實驗結(jié)果 在接種后3 h之內(nèi)，試驗組D中1只小鼠死亡，剖檢無明顯病理變化。12 h之內(nèi)，試驗組A和B各有1只小鼠死亡，剖檢可見心包淤血，肝臟腫大，小腸有紅棕色水樣稀糞(見中插彩版圖1)。其余小鼠反應(yīng)遲鈍，食欲減退，精神沉郁。24 h之內(nèi)C組未發(fā)生小鼠死亡。對照組小鼠始終正常。

2.4 毒力基因檢測結(jié)果 對分離株的8種毒力基因進(jìn)行PCR檢測，測結(jié)果見表3。所有菌株均攜帶有2個以上的毒力基因，其中1株菌攜帶有高達(dá)6個毒力基因。毒力基因aatA的檢出率最高為100%；irp2檢出率次之為75%；papC、iucD、vat、iss檢出率均為50%；毒力基因tsh和cva/cvi未檢出。

表3 大腸桿菌毒力基因檢測結(jié)果

3 討論

野生動物的耐藥性相對研究較少，有文獻(xiàn)表明，圈養(yǎng)虎源大腸桿菌同樣表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，如對哈爾濱市東北虎林園虎源大腸桿菌，對氨芐西林耐藥率為100 %，四環(huán)素和復(fù)方新諾明的耐藥率均高于80%[4]；有時不僅耐藥率高，其相應(yīng)耐藥基因攜帶率也高，如30株虎大腸桿菌對氯霉素的耐藥率為85%，對氟苯尼考的耐藥率為78%，其耐藥基因cmlA檢出率高達(dá)70%[5]。龍巖梅花山虎園華南虎主要是圈養(yǎng)管理，本研究中所檢大腸桿菌對受試的抗菌藥物呈多重耐藥性，并且對復(fù)方新諾明100% 耐藥。耐藥性的產(chǎn)生為臨床有效治療帶來了極大的困難，因此，確定致病性大腸桿菌的耐藥譜，尋找最佳療效的藥物成為科學(xué)防治大腸桿菌病的必要措施。

為確認(rèn)分離株是否為致病菌，本研究結(jié)合動物實驗和PCR方法對其致病性進(jìn)行檢測。雖然大腸桿菌的致病性主要集中在某些特定的血清型[6]，但是有研究表明，血清型相同，菌株間攜帶毒力相關(guān)基因存在差異[7]。因此有必要對毒力因子攜帶情況進(jìn)行研究，其中與大腸桿菌感染有關(guān)的毒力因子主要有粘附素和毒素。本試驗除了做動物實驗外，還對其毒力基因進(jìn)行檢測。分離株在12 h～48 h內(nèi)致小鼠死亡，均含有8種毒力基因中的2種及2種以上。接4號大腸桿菌小鼠死亡時間最快，攜帶有6種毒力基因，致病性最高。1號和2號大腸桿菌分別攜帶有4種和3種毒力因子，其致病性高于3號菌株。結(jié)合本次的動物實驗，毒力基因攜帶情況可以反映出其致病力的高低。謝和平等研究表明，虎源大腸桿菌同時攜帶irp2、iucD和iss基因，其毒力較強(qiáng)在36 h內(nèi)攻毒小鼠的死亡率高達(dá)100%[1]。在本試驗中以上3種毒力基因均有檢測，其中irp2檢出率最高(3/4)，iucD和iss檢出率相同(2/2)，毒力基因的攜帶率較高。

通過本次對虎源大腸桿菌的耐藥性和致病性的研究，盡管樣本數(shù)不大，但是發(fā)現(xiàn)了圈養(yǎng)虎腸道中攜帶的大腸桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，并且顯示出明顯的致病性。因此，圈養(yǎng)虎攜帶病原菌的耐藥性和致病性應(yīng)引起廣大科研工作者的重視。

[1] 謝和平，朱慶艷，陳武，等. 華南虎源大腸桿菌的快速鑒定及致病特性的初步研究[J]. 野生動物,2012(03):109-112.

[2] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Twentieth Informational Supplement M100-S20. CLSI Wayne P A[J]. USA， 2010.

[3] 張宇曦，韓先干，左佳坤，等. 禽致病性大腸桿菌脂多糖核心型分布與毒力基因的相關(guān)性分析[J]. 微生物學(xué)通報,2015，42(08):1 619-1 625.

[4] 薛原，李鳳勇，孫靜，等. 虎源大腸桿菌耐藥性的檢測與分析[J]. 經(jīng)濟(jì)動物學(xué)報,2013，16(01):31-34.

[5] 薛原，王曉菲，陳建飛. 圈養(yǎng)虎源大腸桿菌中氯霉素類藥物耐藥基因的調(diào)查[J]. 經(jīng)濟(jì)動物學(xué)報,2016，19(01):33-35.

[6] Frydendahl K. Prevalence of serogroups and virulence genes in Escherichia coli associated with postweaning diarrhoea and edema disease in pigs and a comparison of diagnostic approaches[J]. Vet Microbiol，2002,85(2):169-182.

[7] 王秀梅，蔣紅霞，廖曉萍，等. 豬源致病性大腸桿菌的血清型、毒力基因及抗菌藥耐藥性的調(diào)查[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2010，43(19):4 109-4 115.