王?；?， 徐耀輝 ， 苗 麗 ， 陳 靜 , 李文剛

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046 ；2.河南出入境檢驗(yàn)檢疫局 ， 河南 鄭州 450003)

雞沙門菌是由多個(gè)血清型的沙門菌引起的一類傳染病，雞沙門菌以雞白痢沙門菌和腸炎沙門菌較常見，兩者引起的雞群發(fā)病癥狀非常相似，但腸炎沙門菌能夠在禽類及其產(chǎn)品中穩(wěn)定傳播，其宿主比雞白痢沙門菌更為廣泛，是目前人類食物中毒的主要病原菌之一，這不僅影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展，還威脅人類健康?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型快速可靠的細(xì)菌鑒定方法[1]。操作快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)，本試驗(yàn)應(yīng)用MALDI-TOF-MS對(duì)河南地區(qū)規(guī)?；N雞場(chǎng)致死雞胚和肝臟中分離的41株疑似沙門菌進(jìn)行鑒定，并用血清學(xué)方法進(jìn)行比較，旨為獸醫(yī)臨床沙門菌的鑒定和防治提供一種方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 河南地區(qū)規(guī)?；N雞場(chǎng)疑似沙門菌致死雞胚，雞肝臟等。

1.2 主要儀器 MALDI Biotyper 高通量微生物鑒定系統(tǒng)，購(gòu)自德國(guó)Bruker Dahonics公司，參數(shù)設(shè)置：線性操作模式，正離子，基質(zhì)抑制偏轉(zhuǎn)模式。脈沖離子提取時(shí)間：100 ns。相對(duì)分子質(zhì)量：2 000～20 000 D；VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃中國(guó)有限公司。

表1 41株疑似沙門菌血清學(xué)、MALDI-TOF-MS和VITEK-2鑒定結(jié)果比較

1.3 主要試劑 沙門診斷血清，購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 生化鑒定 用比濁儀將所檢測(cè)細(xì)菌濁度調(diào)整到0.5～0.63麥?zhǔn)蠞岫确秶鷥?nèi)，利用VITEK-2中GN鑒定卡對(duì)沙門菌可疑菌株進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2 MOLDI-TOF-MS鑒定 挑取沙門菌顯色培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落(少量)，直接涂抹到MALDI靶板上，自然干燥后加1μL HCCA 基質(zhì)液覆蓋樣品，室溫晾干后放入質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)量。打開FlexControl軟件，采集數(shù)據(jù)圖譜，通過(guò)Biotyper 軟件進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果判斷：使用MALDI Biotyper 3數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)，標(biāo)準(zhǔn)如下，得分為2.300～3.000完全可靠地鑒定到種的水平；得分為2.000～2.299可靠鑒定到屬的水平，有可能鑒定到種的水平；得分為1.700～1.999有可能鑒定到屬的水平；0.000～1.699，沒(méi)有可信的鑒定結(jié)果。本研究均選取分值≥2.300的結(jié)果作為待測(cè)樣本的鑒定結(jié)果。

1.4.3 血清學(xué)鑒定 按照GB4789.4-2010沙門菌檢驗(yàn)的操作方法進(jìn)行血清型的鑒定試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MOLDI-TOF-MS鑒定結(jié)果 來(lái)源于河南各地種雞場(chǎng)致死雞胚和肝臟分離的41株疑似沙門菌株，經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定，分別與沙門菌數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，41株疑似沙門菌的匹配分值均大于2.300，鑒定結(jié)果的可信度很高。

2.2 血清學(xué)、MALDI-TOF-MS和VITEK- 2鑒定結(jié)果比較 從表1可知,生化(VITEK)鑒定結(jié)果是沙門菌，其血清學(xué)和MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果是沙門菌。血清學(xué)鑒定結(jié)果是雞白痢或雞傷寒和布利丹沙門菌，MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果是腸炎沙門菌。而血清學(xué)鑒定是蒙得維的亞沙門菌和賽羅沙門菌，MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果是都柏林沙門菌和哈達(dá)爾沙門菌，說(shuō)明血清學(xué)鑒定和MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果沒(méi)有相關(guān)性。

3 分析與討論

MALDI-TOF-MS能夠準(zhǔn)確快速的檢測(cè)細(xì)菌體內(nèi)生物大分子(蛋白質(zhì)、多肽等)的分子量，它們具有種屬特征，與細(xì)菌進(jìn)化有關(guān)，因此可以作為細(xì)菌鑒定的重要手段[2]，傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法依據(jù)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)和生理生化特性分析，不僅操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，而且由于生化特性容易受培養(yǎng)基、保存時(shí)間等因素的影響，常常給鑒定帶來(lái)困難。MALDI-TOF-MS具有操作簡(jiǎn)單快速、可自動(dòng)化，結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，使其成為細(xì)菌鑒定的新選擇。采用MALDI-TOF-MS方法鑒定細(xì)菌的報(bào)道已有很多[3]，但針對(duì)獸醫(yī)微生物的研究報(bào)道很少。本試驗(yàn)利用MALDI-TOF-MS對(duì)41株沙門菌株進(jìn)行鑒定，操作方便、快捷快速、省時(shí)省力，同時(shí)對(duì)分離的不同菌株的指紋圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)分離的不同株沙門菌之間存在一定的差異。

本研究采集河南地區(qū)規(guī)模化種雞場(chǎng)的致死雞胚和雞肝臟，經(jīng)分離純化后獲得41株沙門菌，分別進(jìn)行血清學(xué)鑒定、生化和MALDI-TOF-MS鑒定，結(jié)果表明3種鑒定方法均能鑒定出沙門菌，但對(duì)于血清分型結(jié)果和MALDI-TOF-MS分型結(jié)果沒(méi)有相關(guān)性，該結(jié)論與之前(王曄茹 2008)報(bào)道的結(jié)果一致[4]。這是由于血清學(xué)特異性反應(yīng)主要針對(duì)的是菌體表面的抗原決定簇，而MALDI-TOF-MS鑒定依據(jù)的是菌體內(nèi)所有特異性的蛋白分子的指紋圖譜，兩者的數(shù)據(jù)差異明顯。

腸炎沙門菌具有垂直傳播的特點(diǎn),能夠在輸卵管和卵黃里分離到,因此食用未完全加熱至熟的蛋品可以導(dǎo)致人類食物中毒。雖然沙門菌對(duì)蛋類食品的污染率相對(duì)較小，卻也能引起更大比例的食源性疾病暴發(fā)。而在雞場(chǎng)的持續(xù)存在，使得養(yǎng)殖的過(guò)程中也很容易造成雞群感染發(fā)病或雞胚孵化失敗，使雞或雞胚死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此，有針對(duì)性地殺滅某些血清型沙門菌對(duì)控制雞及其產(chǎn)品中沙門菌的污染有重要作用。

[1] Jadhav S, Bhave M, Palombo E A. Methods used for the detection and subtyping of Listeria monocytogenes[J]. J Microbiol Methods, 2012,88(3): 327-341.

[2] 胡驍，林肖惠，佟巍，等.沙門菌MALDI-TOF MS 標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)的建立及應(yīng)用研究[J].衛(wèi)生研究，2014,43(1)：40-47.

[3] Santos C, Paterson R R, Venancio A,etal.Filamentous fungal characterizations by Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry[J].J Appl Mivrobiol,2010,108:375-385.

[4] 王曄茹，崔生輝， 李鳳琴.基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在沙門菌檢測(cè)和鑒定分型中的應(yīng)用研究[J].衛(wèi)生研究，2008，37(6)：685-689.