趙柏霞+閆建芳+夏國(guó)芳+李俞濤+潘鳳榮

摘要：分離6年生砂蜜豆/馬哈利櫻桃的根際細(xì)菌，通過(guò)16S rDNA基因序列分析確定分類地位，利用比色法篩選IAA產(chǎn)生菌并定量檢測(cè)其產(chǎn)素能力。研究發(fā)現(xiàn)，共分離獲得52株細(xì)菌，分屬于2個(gè)類群11個(gè)屬的17個(gè)種。對(duì)各代表菌株進(jìn)行產(chǎn)素能力測(cè)定，共發(fā)現(xiàn)15株菌可分泌生長(zhǎng)素，其中A07、A20、B20及B26菌株具有較強(qiáng)的產(chǎn)素能力。馬哈利砧木作為遼東地區(qū)甜櫻桃的主要砧木，其根際促生菌的多樣性分析及菌株利用研究較少，本研究為甜櫻桃增產(chǎn)及生物菌肥開(kāi)發(fā)提供了重要菌株資源。

關(guān)鍵詞：馬哈利櫻桃；根際細(xì)菌；多樣性；吲哚乙酸；產(chǎn)素能力

中圖分類號(hào)： S662.501 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）20-0169-04

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）指生存于植物根際、根表，并能直接或者間接促進(jìn)或者調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的微生物。這類微生物一般具有固氮、解磷、產(chǎn)生植物激素等能力或者至少其中之一的能力。1978年，研究人員首次在馬鈴薯上發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了PGPR，經(jīng)過(guò)了30多年的發(fā)展，這類菌被大量報(bào)道，其中包括了假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、固氮螺菌屬（Azospirillum sp.）[1]、克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.）[2]、芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）[3-4]、固氮菌屬（Azotobacter sp.）、腸桿菌屬（Enterobacter sp.）[5]、節(jié)桿菌屬（Arthobacter sp.）[6]、布克霍爾德氏菌屬（Burkholderia sp.）[7]等。這些菌種部分已經(jīng)作為新型肥料的菌源在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中開(kāi)發(fā)利用。Kumar等從葫蘆巴的根瘤中分離的E. meliloti 和R. leguminosarum具有多重促生活性，并對(duì)Fusarium oxysporum具有一定的拮抗作用[8]。王光華等從大豆根際土壤分離到一株芽孢桿菌BRF-1，該菌對(duì)7種病原菌有較好的拮抗作用[9]。

馬哈利[Cerasus mahaleb （L.） Mill.]是一種歐美普遍應(yīng)用的甜櫻桃砧木，該種櫻桃根系發(fā)達(dá)，固地性好，耐旱、耐寒、耐貧瘠，是我國(guó)北方重要經(jīng)濟(jì)作物甜櫻桃的主要嫁接砧木[10]。其根際促生菌的種類及數(shù)量對(duì)于甜櫻桃產(chǎn)量有重要影響。但目前遼東地區(qū)對(duì)于該砧木根際微生物及PGPR菌的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，其研究對(duì)甜櫻桃的增產(chǎn)及品質(zhì)提高具有重要意義。

本研究對(duì)6年生砂蜜豆/馬哈利櫻桃樹(shù)的根際細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，并以植物生長(zhǎng)素吲哚乙酸（IAA）為指標(biāo)進(jìn)行產(chǎn)素能力測(cè)定，篩選到了馬哈利根際促生細(xì)菌并明確了其產(chǎn)素能力，為生物促生菌肥的開(kāi)發(fā)利用提供了豐富的資源。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

土壤樣品采集自遼寧省大連市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院甜櫻桃園，采集時(shí)選擇生長(zhǎng)良好的6年生甜櫻桃根部土壤，除去土壤表面覆蓋的凋落物及雜物，鏟除表面約5 cm厚的土壤，用滅菌鏟采集5～20 cm深的根際土壤，裝于滅菌袋中，過(guò)20目篩后4 ℃保存。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2。IAA檢測(cè)培養(yǎng)基為含L-色氨酸LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，色氨酸100 mg/L，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2。

1.3 菌株分離純化

采用梯度稀釋法分離土壤中細(xì)菌菌株，純化后編號(hào)LB斜面上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 16S rDNA擴(kuò)增

將菌株用LB培養(yǎng)液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）提取菌株總DNA。以細(xì)菌通用引物27F/1525R（引物1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；引物2：5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL PCR反應(yīng)體系為T(mén)aq酶（5 U/μL）0.3 μL，10×Buffer（Mg2+）4 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，引物（10 μmol/L）各2 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 37.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、5 min；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃、5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，4S Red（上海生工）染色后，在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）中觀察照相。

1.5 測(cè)序

16S PCR產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在EzTaxon網(wǎng)站與細(xì)菌模式菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)。用MEGA 6.0 對(duì)16S rDNA 基因相似度高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。將測(cè)得的16S rDNA全序列提交Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)（Http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）獲得序列登錄號(hào)。

1.6 IAA產(chǎn)生菌的篩選

將分離純化后的細(xì)菌接種于含有L-色氨酸（100 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)1 d。按照Libbert等的方法[11]進(jìn)行顯色反應(yīng)。以加入50 μL IAA[50 mg/L，生工生物工程（上海）有限公司，純度>99%]的標(biāo)準(zhǔn)液作為陽(yáng)性對(duì)照，以加入50 μL無(wú)菌培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照。白色陶瓷板置于避光條件下、室溫反應(yīng)30 min后，觀察顏色變化，顏色變紅者表示能夠產(chǎn)IAA，且顏色越深表示分泌的能力越強(qiáng)，否則表示不能產(chǎn)生IAA。

1.7 IAA產(chǎn)素能力的測(cè)定

采用上述培養(yǎng)條件，對(duì)初篩獲得能夠分泌IAA的根際細(xì)菌進(jìn)行定量測(cè)定，測(cè)定菌懸液的D600 nm值后，將菌懸液 10 000 r/min 離心10 min，取上清液按照Glickmann等的方法[12]測(cè)定D530 nm值。同時(shí)以分析純IAA繪制吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，以計(jì)算待測(cè)樣品中IAA含量。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增與測(cè)序

通過(guò)稀釋分離法分離到細(xì)菌菌株52株，挑取培養(yǎng)形態(tài)不一致的菌株，以27F/1525R為引物進(jìn)行16S rDNA片段擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為1 400 bp的擴(kuò)增片段，將所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后得到的基因序列與EzTaxon細(xì)菌模式菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，用MEGA 6.0 對(duì)16S rDNA基因相似度高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。將序列提交GenBank，所得收錄號(hào)為KX792235～KX792257。

試驗(yàn)結(jié)果（圖1、表1）顯示，篩選出的菌株分布在細(xì)菌域2個(gè)綱11個(gè)屬17個(gè)種中。其中放線菌門(mén)（Actinobacteria）最多，占約70%，為最優(yōu)勢(shì)類群，分別歸屬于微球菌屬（Micrococcus）、紅球菌屬（Rhodococcus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）等。其次是厚壁菌門(mén)，其中共有6株細(xì)菌與芽孢桿菌屬（Bacilus）相似度高達(dá)99%～100%，占85.7%，為分離到的最優(yōu)勢(shì)菌屬。

2.2 IAA產(chǎn)生菌的篩選

根據(jù)分離純化結(jié)果，以23株根際細(xì)菌為代表進(jìn)行分泌IAA性能測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明，23株根際細(xì)菌中共有15株具有分泌IAA的能力，但存在一定的差異。4株深粉色，4株粉色，7株淺粉色，顏色越深表明分泌IAA的能力越強(qiáng)（表2）。

2.3 PGPR菌的IAA產(chǎn)生能力測(cè)定

將初篩的具有分泌IAA能力的菌株進(jìn)行定量測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IAA產(chǎn)生能力。結(jié)果（圖2、圖3）發(fā)現(xiàn)，分離自馬哈利櫻桃根際土壤的2個(gè)綱的根際細(xì)菌均有分泌IAA的能力，但是分泌能力有明顯差異。其中顯示深粉色的4株細(xì)菌為厚壁菌門(mén)中的B20（Bacillus aryabhattai）分泌能力最強(qiáng)，產(chǎn)IAA量為33.07 mg/L；其次是放線菌門(mén)的A07（Patulibacter americanus），產(chǎn)IAA量為21.24 mg/L；放線菌門(mén)的B26（Microbacterium oleivorans）分泌量位居第3，產(chǎn)IAA量為1890 mg/L；第4為放線菌門(mén)的A20（Agromyces neolithicus），分泌量為 18.84 mg/L。

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)遼東地區(qū)重要經(jīng)濟(jì)作物甜櫻桃的主要砧木馬哈利根際的可培養(yǎng)細(xì)菌種群進(jìn)行了研究，共分離獲得52株細(xì)菌，分布屬于11個(gè)屬的17個(gè)種，顯示了櫻桃根際可培養(yǎng)細(xì)菌豐富的種群多樣性。經(jīng)顯色篩選發(fā)現(xiàn)15株細(xì)菌可分泌生長(zhǎng)素或其類似物，其中Patulibacer sp. A07、Agromyces sp. A20、Bacillus sp. B20 及 Microbacterium sp. B26菌株具較強(qiáng)的產(chǎn)IAA能力，均達(dá)到18 mg/L以上。這些種屬和已經(jīng)報(bào)道過(guò)的PGPR相似[13]。其中B20和B26所屬的Bacillus、Microbacterium屬已經(jīng)在蔬菜、煙草及果樹(shù)上被大量報(bào)道了具有促生功能[5，14-15]。而Patulibacer sp.和Agromyces sp.在國(guó)內(nèi)外都罕有報(bào)道，本試驗(yàn)首次從馬哈利櫻桃根際分離到，并檢測(cè)到具有產(chǎn)IAA能力。其中A07、B20等在盆栽試驗(yàn)中具有較好的促生作用（另文發(fā)表）。

大量資料表明，植物根際細(xì)菌是篩選PGPR的重要資源庫(kù)?，F(xiàn)有報(bào)道表明假單胞菌屬和芽孢桿菌屬的植物根際細(xì)菌具有防病促生的能力[16-17]。PGPR集中的一些菌屬有假單胞菌屬（Pseudomonas）、布克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等。本試驗(yàn)分離出的馬哈利根際產(chǎn)IAA細(xì)菌，歸屬于4個(gè)目10余個(gè)屬，即使有些菌種產(chǎn)IAA能力較低，但在一定程度上反映出馬哈利根際土壤中蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源。這些菌種的產(chǎn)素能力受培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等因素影響很大。因此，可以通過(guò)篩選培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)條件來(lái)提高產(chǎn)素能力。

本試驗(yàn)首次對(duì)砂蜜豆/馬哈利櫻桃的根際微生物進(jìn)行研究，篩選出近60%的根際細(xì)菌都是具有產(chǎn)IAA能力的，這將為甜櫻桃生物菌肥產(chǎn)業(yè)提供巨大的微生物資源，創(chuàng)造良好的根際生態(tài)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)遼東經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步增產(chǎn)創(chuàng)收。

參考文獻(xiàn)：

[1]王繼文，謝寶恩，周付忠，等. 高產(chǎn)吲哚乙酸及高泌氨巴西固氮螺菌的篩選與鑒定[J]. 生物技術(shù)，2009，19（6）：14-17.

[2]呂澤勛，宋 未. 培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酸克雷伯氏菌SG-11生物合成IAA影響的研究[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2000，6（1）：66-69.

[3]李振東，陳秀蓉，李 鵬，等. 珠芽蓼內(nèi)生菌Z5產(chǎn)IAA和抑菌能力測(cè)定及其鑒定[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（2）：61-68.

[4]吳 翔，甘炳成，黃忠乾，等. 一株產(chǎn)IAA菌株的篩選、鑒定及培 養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，32（4）：432-435.

[5]陳 波，丁延芹，馬海林，等. 櫻桃根際促生細(xì)菌的篩選與鑒定[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2012，39（12）：1746-1754.

[6]李 引，虞 麗，李輝信，等. 一株花生根際促生菌的篩選鑒定及其特性研究[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2012，28（4）：416-421.

[7]康貽軍，程 潔，梅麗娟，等. 植物根際促生菌的篩選及鑒定[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2010，50（7）：853-861.

[8]Kumar H，Dubey R C，Maheshwari D K. Effect of plant growth promoting rhizobia on seed germination，growth promotion and suppression of fusarium wilt of fenugreek （Trigonella foenumgraecum L.）[J]. Crop Protection，2011，30（11）：1396-1403.endprint

[9]王光華，周克琴，張秋英，等. 拮抗細(xì)菌BRF-1對(duì)幾種植物病原真菌的抗生效果[J]. 中國(guó)生物防治，2003，19（2）：73-77.

[10]黃文江，劉慶忠，趙紅軍，等. 馬哈利櫻桃葉片再生的研究[J]. 落葉果樹(shù)，2002，34（4）：1-3.

[11]Libbert E，Risch H. Interactions between plants and epiphytic bacteria regarding their auxin metabolism. V. Isolation and identification of the IAA producing and IAA destroying bacteria from pea plants[J]. Physiologia Plantarum，1969，22（1）：51-58.

[12]Glickmann E，Dessaux Y. A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology，1995，61（2）：793-796.

[13]姜曉宇，高菊生，徐鳳花，等. 水稻種子內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其分泌植物生長(zhǎng)素能力的測(cè)定[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2013，53（3）：269-275.

[14]楊 蓉，房世杰，楊文琦，等. 植物根際促生細(xì)菌（PGPR）分離篩選與鑒定[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，48（12）：2337-2342.

[15]馬海林，邢尚軍，劉方春，等. 冬棗（Ziziphus jujube Mill.）根際3株促生細(xì)菌的篩選與鑒定[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2013，19（4）：650-654.

[16]王 平. 小麥根圈細(xì)菌中PGPR的篩選及其初步鑒定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，18（4）：352-356.

[17]劉國(guó)奇. 韭菜根際黃光但單胞菌株的分離和初步研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，1999，26（3）：189-192.endprint