王沛雅+楊暉+郭琪+杜維波+張軍+楊濤

摘要：楊樹作為全球使用最為廣泛的生態(tài)、能源、分子遺傳木本模式植物之一，其種質(zhì)資源研究改良對我國生態(tài)環(huán)境建設(shè)意義重大。綜述不同目的基因（抗蟲、抗病、抗除草劑、抗逆境、降低木質(zhì)素、促生長等）轉(zhuǎn)化楊屬植物的研究與應(yīng)用，分析目前為止楊樹分子改良研究應(yīng)用發(fā)展現(xiàn)狀、存在問題及解決途徑，為楊樹遺傳改良的進(jìn)一步發(fā)展提供參考。

關(guān)鍵詞：楊樹；遺傳；種質(zhì)資源；基因工程；生態(tài)環(huán)境建設(shè)；目的基因；分子改良；研究進(jìn)展；存在問題；解決途徑

中圖分類號： S792.110.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0017-07

楊樹是楊柳科（Salicaceae）楊屬（Populus）物種的統(tǒng)稱，全球約有100多種，一般在北緯30°～72°范圍，垂直分布多在海拔3 km以下[1]。楊樹是優(yōu)良的造林綠化樹種、建筑用材和造紙原料，此外，楊樹擁有很高的生物質(zhì)產(chǎn)量，是重要的可再生生物質(zhì)能源植物。楊屬植物單倍體基因組含有19條染色體，DNA含量為1.2 pg，總遺傳圖距約為2 500 cM [2-3]。楊屬植物因其基因組具有構(gòu)成精簡、物種豐富、分布廣泛、童期短、生長快、遺傳轉(zhuǎn)化容易、再生能力強、嚴(yán)格的異交樹種、位點組成高度雜合，已構(gòu)建成較飽和的各種連鎖圖等這些特點，使其成為林木基因工程模式物種[4-6]。2011年7月北京林業(yè)大學(xué)的科學(xué)家以百年古樹——白楊組毛白楊（Populus tomentosa）為樣本，繪制完成了毛白楊的基因組序列圖譜，這標(biāo)志著楊樹分子育種正式進(jìn)入基因組時代，推動了楊樹育種技術(shù)的全面進(jìn)步。

楊樹作為保護脆弱生境環(huán)境的生態(tài)樹種，須要耐受惡劣的自然環(huán)境（如干旱、低溫、鹽堿、病蟲害等），因此培育生長迅速、抗逆性強的楊樹品種一直是全球相關(guān)科學(xué)家努力的方向之一。相對于常規(guī)育種方法費時長、效率低的缺陷，現(xiàn)代分子育種方法高效、靶向的優(yōu)點為楊樹改良品種開辟了新的途徑。Fillatti等將從沙門氏菌中分離出來的AroA基因?qū)霔顦銷C-5339無性系并獲得了一批抗草甘膦植株[7]，使人們對樹木育種研究的認(rèn)識有了重大的改變，基因工程逐漸成為樹木育種研究的焦點。1991年我國首次利用抗蟲基因成功轉(zhuǎn)化了歐洲黑楊[8]。到目前為止，進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因樹木有30多個屬，而研究最多、應(yīng)用最廣泛的為楊屬，約占50%[9]。眾多科學(xué)家通過分子遺傳轉(zhuǎn)化的方法對楊樹現(xiàn)有品種進(jìn)行了優(yōu)化改良，尤其是在抗性育種（包括抗蟲、抗病、抗旱、耐鹽堿等）方面。對近年來楊樹轉(zhuǎn)基因的研究應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)分析，以期為楊樹的分子育種研究及其應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展提供參考。

1 不同目的基因的楊樹轉(zhuǎn)化

1.1 抗蟲基因轉(zhuǎn)化

楊樹的蟲害十分普遍，主要類型有蛀干害蟲，如光肩星天牛、桑天牛、云斑天牛等； 食葉害蟲，如楊尺蠖、分月扇舟蛾、楊梢葉甲等；枝梢害蟲和吸汁害蟲，如楊黃卷葉螟、草履蚧等，每年給楊樹的生長和生產(chǎn)造成巨大的損失?？瓜x基因工程為解決這一問題提供了非常有效的方法，我國對抗蟲轉(zhuǎn)基因楊樹研發(fā)處于國際前列，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已獲得多種轉(zhuǎn)基因抗蟲楊樹，有效降低了林木蟲害的危害。

1.1.1 轉(zhuǎn)單個抗蟲基因 1993年田穎川等用帶有35S-Ω-Bt-Nos嵌合基因的雙元載體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化歐洲黑楊的葉片外植體，獲得再生植株，對楊尺蠖的毒理試驗表明，5～9 d內(nèi)死亡率達(dá)80%～96%，存活昆蟲的生長和發(fā)育受到明顯抑制[10]。大田試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因歐洲黑楊田間抗蟲效果明顯，轉(zhuǎn)基因試驗林葉片損失率不超過20%，健楊林帶和歐洲黑楊林帶土壤中的蟲蛹數(shù)分別為轉(zhuǎn)基因試驗林土壤中蟲蛹數(shù)的4.9、4.1倍[11]。2002年轉(zhuǎn)抗蟲基因歐洲黑楊獲得了商品化許可，2003年通過良種審定，我國成為世界上第1個商業(yè)化栽培轉(zhuǎn)基因林木的國家[12]。還有其他殺蟲基因也被導(dǎo)入楊樹中，郝貴霞等將廣譜抗蟲基因豇豆蛋白酶抑制劑基因（cowpea trypsin inhibitor，簡稱CpTI）導(dǎo)入毛白楊雌株和毛新楊×毛白楊回交雜種，獲得轉(zhuǎn)基因植株，現(xiàn)已進(jìn)入大田檢測階段[13]。伍寧豐等將昆蟲特異性神經(jīng)蝎毒素基因（AaIT）導(dǎo)入楊樹雜種N-106，獲得的轉(zhuǎn)基因植株A5對1齡舞毒蛾幼蟲的蟲試7 d的死亡率達(dá)80%[14]。

1.1.2 轉(zhuǎn)雙抗蟲基因 研究表明，昆蟲易對單個基因產(chǎn)生耐受性，將多個不同類型的抗蟲基因?qū)胫参?，轉(zhuǎn)基因植株的殺蟲活力增強。2000年，李明亮等用農(nóng)桿菌介導(dǎo)2次轉(zhuǎn)化的方法，將蛋白酶抑制劑基因（proteinase inhibitor，簡稱PI）導(dǎo)入含Bt基因的歐洲黑楊，含有雙抗基因楊樹的抗蟲能力明顯高于含單一Bt毒蛋白基因或單一PI基因的植株[15]。饒紅宇等采用雙基因共轉(zhuǎn)法將經(jīng)改造的Bt-Cry1Aa基因和CpTI基因轉(zhuǎn)入楊樹NL-80106，獲得的轉(zhuǎn)雙價基因楊樹對1齡舞毒蛾幼蟲有明顯的殺蟲活性，轉(zhuǎn)Bt基因的植株經(jīng)過2～3年的抗蟲測定和優(yōu)良性狀選擇，目前已有3個無性系在我國6個省種植進(jìn)行評估[16]。鄭均寶等首次將Bt毒蛋白基因和ApI構(gòu)建成一個雙價表達(dá)載體成功導(dǎo)入741楊，對美國白蛾、楊扇舟蛾、楊小舟蛾、古毒蛾、舞毒蛾、盜蛾等具有較高抗蟲性，幼蟲總死亡率達(dá)83%～90%，這是國內(nèi)外首次報道用雙價抗蟲基因獲得的抗蟲楊植株[17]。張冰玉等將BtCry3A和OCI導(dǎo)入銀腺雜種楊基因組中，獲得轉(zhuǎn)雙價抗蛀干害蟲基因楊樹，并初步篩選出抗性株系[18]。諸葛強等以南林895楊為受體，進(jìn)行了Bt基因和CpTI基因的遺傳轉(zhuǎn)化，飼蟲試驗結(jié)果表明，楊小舟蛾的生長發(fā)育受到了明顯抑制[19]。

1.1.3 轉(zhuǎn)抗蟲基因楊樹的生物安全性研究 我國在抗蟲轉(zhuǎn)基因方面的技術(shù)體系已基本成熟，具備不斷推出抗蟲基因工程新品種并用于楊樹人工林建設(shè)的能力，走在世界研究的前列。隨著抗蟲轉(zhuǎn)基因楊樹的環(huán)境釋放及其商業(yè)化，近年來的研究多針對轉(zhuǎn)抗蟲基因楊樹的生物、生態(tài)安全性探討[20-23]。endprint

1.2 抗病基因轉(zhuǎn)化

由于抗病基因常與一些不良基因連鎖在一起，往往并非僅由單基因控制，所以利用有性雜交的傳統(tǒng)抗病育種研究受到一定程度的局限。目前，克隆的抗病基因主要有2類：抗病毒基因和抗菌基因?？共《净虻难芯恐饕峭ㄟ^導(dǎo)入病毒外殼蛋白基因，并借助交叉保護作用機制，達(dá)到降低病毒侵染的目的。楊樹抗菌性研究的主要病害有楊樹潰瘍病、爛皮病、銹病，導(dǎo)入的抗菌基因主要有幾丁質(zhì)酶基因、抗菌肽基因（天蠶素基因、防御素基因等）。將幾丁質(zhì)酶基因?qū)霔顦?，通過幾丁質(zhì)酶對真菌或細(xì)菌細(xì)胞壁成分幾丁質(zhì)的降解達(dá)到抑菌的目的?？咕氖菑V泛存在于動植物體中的一類廣譜微生物抗性肽，其以物理的方式作用于微生物的細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜穿孔、細(xì)胞質(zhì)外溢而將微生物殺死。

1.2.1 抗病毒基因轉(zhuǎn)化 在楊樹的抗病毒基因研究中，英國牛津大學(xué)病毒所Cooper領(lǐng)導(dǎo)的研究小組將克隆的楊樹花葉病毒（poplar mosaic virus，簡稱PMV）外殼蛋白基因（PMV-cp）導(dǎo)入楊樹，育成了抗楊樹病毒病的無性系，對楊樹PMV的侵染起到一種類似于免疫學(xué)的交叉保護作用[24]。在楊樹的抗菌基因研究中，Rradshaw等從楊樹中克隆出類似于大豆胰蛋白酶抑制劑和幾丁質(zhì)酶的損傷激活基因的cDNA并進(jìn)行了轉(zhuǎn)化研究[25]。Nicolescu等將矮牽牛查爾酮合成酶CHSA基因?qū)霔顦?，提高楊樹的抗病性[26]。Mentag等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗菌肽基因D4E1轉(zhuǎn)入雜交楊樹中，轉(zhuǎn)化植株對多種病菌均有明顯抗性[27]。

1.2.2 抗病菌基因轉(zhuǎn)化 國內(nèi)學(xué)者趙世民等將兔防御素基因NP-1導(dǎo)入毛白楊，轉(zhuǎn)基因植株組織提取液對枯草桿菌、農(nóng)桿菌、立枯病原菌等的生長均有抑制作用[28]。Liang等將小麥的草酸鹽氧化酶（oxalate oxidase，簡稱OxO）基因轉(zhuǎn)化雜交楊樹無性系，提高了轉(zhuǎn)化植株的抗病和抗脅迫能力[29]。孟亮等利用植物幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化美洲黑楊，提高了美洲黑楊對部分真菌性病害的抗性[30]。Jia等分別將來源于球孢白僵菌的幾丁質(zhì)酶基因Bbchit1與益母草的陽離子抗菌肽基因LJAMP2成功導(dǎo)入毛白楊中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bbchit1基因楊樹對葉枯病具有良好的抗病效果，轉(zhuǎn)LJAMP2基因楊樹能顯著提高潰瘍病抗病性[31-32]。牛慶霖等將β -1，3-葡聚糖酶基因（BG2）轉(zhuǎn)入歐美楊107楊中，經(jīng)抑菌試驗表明，BG2基因的表達(dá)提高了107楊對楊樹潰瘍病的抗性[33]。黃艷等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的二次遺傳轉(zhuǎn)化，將Bbchit1基因轉(zhuǎn)入過量表達(dá)無色花色素還原酶基因LAR3轉(zhuǎn)基因毛白楊中，結(jié)果表明，Bbchit1+LAR3共表達(dá)轉(zhuǎn)基因毛白楊細(xì)胞粗提液對楊樹葉枯病菌具有明顯的抑制作用，進(jìn)一步將葉枯病菌接種在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因毛白楊葉片上培養(yǎng)30 d，轉(zhuǎn)基因植株的感病面積均低于非轉(zhuǎn)基因植株且Bbchit1+LAR3共表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系抗病效果更明顯[34]。

目前為止，國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因的抗楊樹葉銹病、抗楊樹葉枯病、抗日本山楊腫瘤病等的研究還在進(jìn)一步的試驗當(dāng)中。近些年來，人們利用多種基因克隆技術(shù)，如圖位克隆法、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法等，克隆出了大量的抗病基因，相信這些基因的發(fā)現(xiàn)將給抗病基因工程帶來巨大的推動力，將會有更多成功的報道。

1.3 抗除草劑基因轉(zhuǎn)化

抗除草劑基因已經(jīng)成功應(yīng)用于林木基因工程研究。例如草甘膦，作為一種篩選標(biāo)記既可用于轉(zhuǎn)化植株的篩選，又便于轉(zhuǎn)基因植株的苗期除草管理。除草劑的應(yīng)用在發(fā)達(dá)國家已相當(dāng)普及，幾乎85%～100%的栽培作物上都使用除草劑。1987年，F(xiàn)illatti等將aroA基因轉(zhuǎn)入楊樹無性系NC-5339，首次報道培育出楊樹抗除草劑植株，這是楊樹抗性基因工程研究的開端，也是基因工程技術(shù)在林木遺傳育種中應(yīng)用成功的首例[7]。de Block 將抗膦絲菌素除草劑基因轉(zhuǎn)入楊樹[35]。Chupeau等以楊樹葉片原生質(zhì)體作為受體，運用電激法將乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，簡稱Als）突變基因轉(zhuǎn)入楊樹，獲得了抗磺胺脲類的楊樹植株；又分別轉(zhuǎn)化乙酰轉(zhuǎn)移酶（phosphinothricin acetyltransferase，簡稱PAT）基因和新霉素磷酸移酶（neomycin phosphotransferase，簡稱NPT）基因，獲得了抗草苷膦類除草劑的楊樹植株[36]。Confalonieri等得到了高抗草丁膦類除草劑-Basta的轉(zhuǎn)基因銀白楊[37]。Gullner等將編碼專一性抗除草劑乙酰替氯苯胺的谷氨酰丙氨酶（glutathione S-transferase，簡稱GST）基因轉(zhuǎn)入楊樹雜交種內(nèi)，轉(zhuǎn)基因植株葉片的γ-GST和還原性谷胱甘肽（glutathione，簡稱GSH）含量提高，楊樹的除草劑抗性也得到提高[38]。2002年，Meilan等獲得了一批攜帶有CP4基因的抗草甘膦白楊雜種[39]。

抗除草劑轉(zhuǎn)基因植株可能出現(xiàn)負(fù)面影響，在抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)用的同時，農(nóng)作人員會因為他的目標(biāo)植物耐受除草劑，反而會加大除草劑的使用量，增加了土壤以及植株中的除草劑殘留。這個度的把握還需要科研人員與農(nóng)作人員共同去實踐摸索。

1.4 抗逆境基因轉(zhuǎn)化

由于環(huán)境的不斷惡化，越發(fā)嚴(yán)重的非生物脅迫降低了林木產(chǎn)量。氧化劑、低溫、土壤的鹽漬化和沙漠化是限制森林樹木生長生存的重要因素，利用基因工程技術(shù)培育抗氧化、耐霜凍、耐干旱、耐鹽堿等品質(zhì)的樹木新品種無疑具有廣闊的應(yīng)用前景。楊樹的抗逆性研究主要集中在耐鹽、抗旱、抗寒等方面。用于抗逆研究的基因主要有編碼細(xì)胞滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)基因、逆境誘導(dǎo)的植物蛋白激酶基因、抗氧化基因、保護生物大分子及膜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)基因、編碼轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)基因等。

1.4.1 抗旱及耐鹽堿基因轉(zhuǎn)化 我國森林覆蓋率僅為1821%，且分布不均，嚴(yán)重的干旱、半干旱、鹽堿地、荒漠化等極端脆弱生態(tài)區(qū)已占國土面積的近1/2，鹽漬化土地近0.4億hm2?？购怠⒛望}堿林草品種培育是實現(xiàn)困難立地造林、植被恢復(fù)的前提，可以阻止荒漠化、鹽漬化的進(jìn)一步加劇，又能擴大種植面積，解決人口增加與耕地驟減的矛盾，促進(jìn)我國生態(tài)環(huán)境特別是脆弱生態(tài)環(huán)境建設(shè)，保障社會經(jīng)濟發(fā)展和人們生產(chǎn)生活安全[40]。endprint

有學(xué)者將來自枯草桿菌的果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因（SacB）導(dǎo)入銀腺楊，SacB基因在50個無性系中獲得表達(dá)，生物學(xué)檢測也證明植株的抗旱能力明顯提高[41-42]。研究人員將來自極端抗逆木本植物霸王C2H2鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因（ZxZF）作為外源基因，對歐美楊渤豐1號進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因株系葉片相對含水量和脯氨酸含量均顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株10%以上，轉(zhuǎn)基因株系抗旱性得到一定程度提高[43-44]。王沛雅等將油菜素內(nèi)酯合成酶基因DAS5轉(zhuǎn)入河北楊中，在干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株的生長狀況和相關(guān)生理生化指標(biāo)測定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)DAS5基因河北楊的抗旱能力明顯提高[45]。

經(jīng)多年研究，2004年世界上第1個可用于大田生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因抗鹽堿楊樹——中天楊（ 八里莊楊） 培育成功，由中國科學(xué)院、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東金水木抗逆植物研究院聯(lián)合成立的課題組將mtlD基因轉(zhuǎn)入其中。1996年，研究人員將mtlD基因?qū)肓税死锴f楊，獲得了一批具較高抗鹽性的轉(zhuǎn)化植株，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化植株較對照有明顯提高，生長良好。后續(xù)的大田釋放造林試驗驗證，與對照相比，轉(zhuǎn)mtlD基因楊樹的造林成活率明顯提高，在0.3%～0.4%土壤鹽化范圍內(nèi)提高0.7倍；林木生長量顯著增大、樹體健壯、耐鹽能力增強，轉(zhuǎn)基因楊的田間耐鹽極限為土壤含鹽量的0.43%，可在中度鹽堿地上正常生長[46]。劉桂豐等以小黑楊花粉植株為受體將betA基因轉(zhuǎn)入小黑楊，經(jīng)檢測獲得的4個轉(zhuǎn)基因株系的甜菜堿含量顯著高于對照，顯著提高了轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性[47]。轉(zhuǎn)膽堿氧化酶基因（codA）的小黑楊也已被轉(zhuǎn)化成功，耐鹽性試驗證明轉(zhuǎn)化植株能在0.6%的NaCl 濃度下生長[48]。楊春霞等將脅迫脫水應(yīng)答基因DREB1C轉(zhuǎn)入南林895抗性試驗結(jié)果初步表明，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性、耐鹽性均有所提高[49]。

藺娜將甜菜堿醛脫氫酶（betaine aldehyde dehydrogenase，簡稱BADH）基因和膽堿單加氧酶（choline monooxygenase，簡稱CMO）以2個獨立的表達(dá)框形式構(gòu)建在1個載體上，轉(zhuǎn)入三倍體毛白楊中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)BADH+CMO植株的抗旱、耐鹽、抗氧化，耐高/低溫能力均高于轉(zhuǎn)BADH、轉(zhuǎn)CMO及野生型植株[50]。姜超強等將擬南芥的AtNHX1基因轉(zhuǎn)入楊樹Tr品系，顯著提高了楊樹的耐鹽性[51]。2010年，周陳力分別將吉春半乳糖苷酶基因AtGolS2和蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶基因SRK2C轉(zhuǎn)入南林895楊，耐鹽性初步試驗表明，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性有一定程度的提高[52]。

1.4.2 抗氧化基因轉(zhuǎn)化 由于環(huán)境的污染及大氣層的破壞，臭氧逐漸成為森林樹木的重要脅迫。一般情況下，臭氧可以破壞植物體內(nèi)抗氧化劑的防御機制、破壞細(xì)胞膜、降低葉綠素的活性及核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶和氧化酶的活性，進(jìn)而降低植物的光合作用，使植物體過早地衰老，同時降低植物體對其他脅迫的抗性。在1998 年，Arisi等將擬南芥的含有結(jié)合鐵的超氧化物歧化酶（Fe-superoxide dismutase，簡稱Fe-SOD）基因?qū)霔顦?，提高了工程植株的耐凍性和抗氧化能力[53]。Gallardo等將松樹胞質(zhì)谷胱苷肽合成酶基因?qū)腚s種楊獲得表達(dá)[54]。Foyer等將谷胱甘肽還原酶基因轉(zhuǎn)入雜種白楊，得到了過量表達(dá)谷胱甘肽還原酶的轉(zhuǎn)基因植株，大大提高了雜種白楊對氧化劑的抗性，同時也解除了光合作用中產(chǎn)生的氧自由基對植物體的光合抑制現(xiàn)象[55]。Strohm等利用谷胱甘肽合成酶基因GshS和谷胱甘肽降解酶基因GR轉(zhuǎn)化雜種楊樹，結(jié)果表明GshS基因和GR基因的過量表達(dá)并不能緩解暴露在高濃度臭氧環(huán)境中轉(zhuǎn)基因楊樹受到的傷害[56]。陳彩霞等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將PeNhaD1基因轉(zhuǎn)入鹽敏感且速生的派間雜種110楊中，獲得轉(zhuǎn)PeNhaD1基因的110楊再生植株[57]。Wang等將Mn-SOD基因?qū)霔顦?，使轉(zhuǎn)基因楊樹SOD活性增強[58]。

1.4.3 抗寒、耐澇基因轉(zhuǎn)化 植物在生長發(fā)育過程中，溫度作為一個重要的環(huán)境因子對其生長、生殖和分布起著關(guān)鍵的作用。低溫不僅在很大程度上限制植物的分布區(qū)域，而且嚴(yán)重影響生物產(chǎn)量，甚至造成大面積死亡。研究人員雖然從生理學(xué)、形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)等多學(xué)科對植物抗凍機制進(jìn)行深入廣泛地研究，找到了一些與抗寒相關(guān)的基因，如抗凍蛋白基因（antifreeze protein gene，簡稱AFP）、低溫信號轉(zhuǎn)錄因子基因（C-repeat binding transcription factor，簡稱CBF）、膜穩(wěn)定相關(guān)基因（FAD、GPAT、SAD）、抗氧化酶活性基因（Fe-SOD、Mn-SOD）、滲透調(diào)節(jié)蛋白（BADH、LEA、SacB），但是目前林木抗寒育種還主要依靠天然雜種選育和人工雜交育種，通過基因工程手段改良林木的抗寒性育種發(fā)展還較為緩慢，尚處在探索階段。法國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（Institut National de la Recherche Agronomique，簡稱INRA）的Lise Jouanin 實驗室將查爾酮合成酶（chalcone synthase，簡稱CHS）基因?qū)霔顦?，轉(zhuǎn)基因植株對低溫的敏感性降低。1998年，Arisi等用擬南芥的Fe-SOD基因轉(zhuǎn)化楊樹時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因楊樹不僅葉綠體中Fe-SOD活性高于對照5～ 8倍，而且楊樹的抗凍性也明顯提高[53]。李春霞從胡蘿卜中克隆到抗凍蛋白基因，對山楊進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，PCR檢測初步證明AFP基因已整合到山楊基因組中[59]。周洲利用2個與增加不飽和脂肪酸相關(guān)的基因（fatty acid desaturase，簡稱FAD）及其相應(yīng)的反義表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化84K楊，對脂肪酸去飽和酶基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控發(fā)現(xiàn)，這2個基因都可以提高轉(zhuǎn)化植株三烯酸的含量，能在一定程度上改變楊樹脂肪酸組成，轉(zhuǎn)化植株在低溫脅迫下表現(xiàn)出較強耐抗能力，這為楊樹的抗寒基因工程育種提供了一個研究方向[60]。2011年，張薇用抗凍轉(zhuǎn)錄因子CBF3基因轉(zhuǎn)化歐美楊108，通過PCR、RT-PCR檢測初步認(rèn)定轉(zhuǎn)化成功，對其抗凍能力還未研究[61]。endprint

楊樹耐澇性較差，南方常常由于大量降水造成長時間積水，給楊樹生產(chǎn)造成了巨大損失。對轉(zhuǎn)基因楊樹的耐澇能力的研究鮮見報道。2009年，李義良等對轉(zhuǎn)透明顫菌血紅蛋白基因（vitreoscilla hemoglobin gene，簡稱vgb）的銀腺楊雜種進(jìn)行耐澇能力的試驗研究，淹水脅迫下vgb基因的表達(dá)增強了銀腺雜種楊葉綠素含量的積累，進(jìn)而促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株的生長，提高了轉(zhuǎn)基因株系對淹水的忍受能力[62]。這是國內(nèi)首例轉(zhuǎn)基因楊樹耐澇性研究。

1.5 降木質(zhì)素基因轉(zhuǎn)化

楊樹木質(zhì)素生物合成基因工程是當(dāng)前研究的熱點，在紙漿和造紙工業(yè)的林木培育中具有廣闊的前景。木質(zhì)素硬度很大，在植物的生長過程中具有很重要的作用，但它的存在嚴(yán)重阻礙了造紙業(yè)的發(fā)展，很難從木漿里將其剔除，須要加入多種化學(xué)試劑去除，增加環(huán)境污染與生產(chǎn)成本。木質(zhì)素的生物合成是一個復(fù)雜的生理生化過程，研究人員通過導(dǎo)入反義抑制、正義共抑制和RNA干擾的相關(guān)酶基因載體方法使木質(zhì)素生物合成過程中一個或幾個酶的表達(dá)抑制，降低木質(zhì)素的含量來改良木材品質(zhì)。

1995年，Doorsselaere等將甲基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)霔顦渲?，其工程植株的甲基轉(zhuǎn)移酶活性減少達(dá)93%[63]。Hu等從白楊中克隆得到4CL基因，通過反義抑制使木質(zhì)素的含量降低45%，而纖維素的含量升高15%，并能大大促進(jìn)白楊的生長[64]。2000年，Jouanin等發(fā)現(xiàn)，由于基因沉默使再生楊樹苗中35S啟動子作用的兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（catecholamine-O-methyl transferase，簡稱COMT）活性降低為0，木質(zhì)素含量降低17%，木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)得到顯著改變，纖維素含量提高，使木質(zhì)素更易被工業(yè)降解，而CAD啟動子作用下的COMT轉(zhuǎn)基因楊樹的纖維素含量增加[65]。2000年，F(xiàn)ranke等在轉(zhuǎn)基因楊樹中證實了F5H的過量表達(dá)對木質(zhì)素單體含量的影響，并認(rèn)為林木中過量表達(dá)F5H是對木質(zhì)素生物合成進(jìn)行修飾的有效代謝基因工程策略[66]。幾乎與國外同步，我國報道了利用反義RNA技術(shù)、通過抑制編碼木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，獲得了木質(zhì)素顯著降低的轉(zhuǎn)基因植株。魏建華等將CCoAOMT基因的反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)入楊樹，檢測發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源CCoAOMT基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均受到抑制，木質(zhì)素含量均有不同程度的降低，其中木質(zhì)素含量下降幅度較大的株系比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障陆底罡呖蛇_(dá)41.73%[67-68]。堿法制漿試驗表明，轉(zhuǎn)基因楊樹在降低堿量的同時，還可以獲得高的紙漿得率，顯示了該轉(zhuǎn)基因楊樹用于紙漿材培育的潛在應(yīng)用價值。賈彩紅等將反義4CL基因轉(zhuǎn)入三倍體毛白楊中發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素含量下降，但總纖維素含量沒有明顯區(qū)別，推測4CL基因可能并非木質(zhì)素與碳水化合物的代謝調(diào)節(jié)點[69]。Li等將反義CoA連接酶基因和有義CAld5H基因同時導(dǎo)入楊樹，獲得了3種工程植株，攜帶反義CoA連接酶基因的植株木質(zhì)素含量降低40%，纖維素增加14%；在攜帶有義CAld5H基因植株中，木質(zhì)素含量基本保持不變；而攜帶2個基因的植株中，木質(zhì)素含量下降52%，纖維素含量增加30%[70]，這個試驗是首次進(jìn)行改良楊樹生物質(zhì)的雙價基因轉(zhuǎn)接，在楊樹木質(zhì)素基因改良工程起到了引領(lǐng)作用。2014年，Wilkerson等將當(dāng)歸的阿魏酸轉(zhuǎn)移酶基因（ferulic acid transferase，簡稱FMT）轉(zhuǎn)入楊樹中，干擾了楊樹的木質(zhì)素的合成，使木質(zhì)素更易處理[71]，此結(jié)果得到了學(xué)術(shù)界的認(rèn)同。

在林木材性轉(zhuǎn)基因改良方面，研究主要集中在改變楊樹木材化學(xué)成分，通過改變木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的含量，木質(zhì)素的化學(xué)組成等，降低造紙成本和減少環(huán)境污染，而對于其物理材性（木材密度、微纖絲角）的改良，基本上還未見報道。

1.6 激素合成酶相關(guān)基因轉(zhuǎn)化

提高林木的生長速率、增加莖干生物量積累、縮短輪伐時間、改良林木的木材性狀是林木育種的重要目標(biāo)。樹木被看作是潛在的低碳生物燃料的重要組成部分，是具有廣闊應(yīng)用前景的生物質(zhì)能源。將激素合成相關(guān)基因?qū)霔顦渲?，有利于提高楊樹生物性能?/p>

Tuominen 等將與生長素合成有關(guān)的IaaM、IaaH基因?qū)霔顦?，獲得2個基因同時表達(dá)的工程植株，使楊樹木材的維管直徑變小、維管密度增大、射線發(fā)育模式發(fā)生改變，該研究團隊又將帶有rolC啟動子的IaaM基因?qū)霔顦?，使工程植株形成層的吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，簡稱IAA）濃度顯著提高[72-73]。Nilsson等將rolC基因?qū)霔顦?，提高了楊樹中游離態(tài)細(xì)胞分裂素的濃度，進(jìn)而影響楊樹的生長和發(fā)育[74]。Eriksson等將赤霉素生物合成關(guān)鍵酶基因GA20導(dǎo)入楊樹，提高了楊樹的生長速率[75]。擬南芥內(nèi)源葡聚糖酶CEL1基因在楊樹中的過量表達(dá)也能顯著增加樹高、葉面積、樹干直徑和纖維素含量[76-77]。李偉等將rolB/pttGA20ox雙價基因?qū)脬y白楊中，獲得4株轉(zhuǎn)基因植株，分析轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化組培苗在生根與生長方面的差異，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)雙價基因銀白楊在形態(tài)特征方面具有rolB 和pttGA20ox 單個基因在其他植物中表達(dá)的優(yōu)良性狀，且生根速度快、量多、轉(zhuǎn)化植株生長率高[78]。郝宇等將多拷貝rolB、rolC基因轉(zhuǎn)入三倍體毛白楊中發(fā)現(xiàn)，rol基因的多拷貝促使轉(zhuǎn)化植株快速大量生成毛狀根[79]。將棉花中的油菜素內(nèi)酯合成酶基因DET2導(dǎo)入毛白楊，可以增加轉(zhuǎn)基因植株的生長量，使木質(zhì)部纖維細(xì)胞增長，還可以打破芽休眠[80-81]。研究人員將油菜素內(nèi)酯合成酶基因DAS5導(dǎo)入河北楊中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)DAS5基因河北楊的生長量顯著提高，特別是根干質(zhì)量顯著增加，同時轉(zhuǎn)化植株較野生型的抗旱能力明顯增強[45，82]。通過研究證實了將激素相關(guān)基因?qū)霔顦洌梢悦黠@改良楊樹的生物特征，進(jìn)而達(dá)到改良生長周期、抗性、木材質(zhì)量的效果。

2 研究進(jìn)展

對林木來說，繁殖周期長、遺傳雜合性高、許多性狀的遺傳機制不明、性狀分析困難及種間地理隔離、生殖隔離等因素的限制，使利用常規(guī)育種手段完成優(yōu)質(zhì)、高抗、高森林生產(chǎn)力等育種目標(biāo)十分困難。借助現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)手段，尤其是利用基因工程手段解決一些用經(jīng)典遺傳育種方法很難解決或根本解決不了的問題，使之成為常規(guī)育種方式的有力補充，大力推進(jìn)我國林木育種進(jìn)程。從第1個轉(zhuǎn)基因楊樹工程植株的產(chǎn)生到現(xiàn)在，已經(jīng)約有30年的時間。在這一時期，分子生物學(xué)、植物組織培養(yǎng)蓬勃發(fā)展，為楊樹轉(zhuǎn)基因打下了牢固的基礎(chǔ)。目前已將不少的目的基因和標(biāo)記基因?qū)霔顦?，完成了遺傳轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)構(gòu)建，有些已經(jīng)開始進(jìn)行商品化生產(chǎn)。endprint

2.1 我國抗蟲轉(zhuǎn)基因研究應(yīng)用處于世界先列，安全性評價同步進(jìn)行

國內(nèi)外對抗蟲轉(zhuǎn)基因楊樹的研發(fā)工作都高度重視，而我國在這一領(lǐng)域的研究水平處于世界前列。由我國林業(yè)科學(xué)院林業(yè)研究所培育的轉(zhuǎn)Bt基因Cry1A歐洲黑楊和河北農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的轉(zhuǎn)雙抗蟲基因（Cry1Ac+API）741楊2個抗食葉害蟲轉(zhuǎn)基因楊樹品種已進(jìn)入了商業(yè)化應(yīng)用階段，我國也因而成為林木抗蟲基因工程應(yīng)用最早的國家，其中轉(zhuǎn)Bt基因歐洲黑楊是目前世界上釋放面積最大的轉(zhuǎn)基因林木品種，栽培面積已達(dá)450 hm2。我國獲得的歐美楊、美洲黑楊、小黑楊、毛白楊等10多個抗蟲轉(zhuǎn)基因楊樹品系（無性系）也已相繼進(jìn)入了田間試驗階段[83]。面對轉(zhuǎn)基因抗蟲楊樹的商業(yè)化步伐，研究人員近幾年來開展了轉(zhuǎn)抗蟲基因楊樹對生態(tài)安全性的評價研究，包括對非靶標(biāo)生物的影響、昆蟲抗性的影響、昆蟲群落結(jié)構(gòu)的影響以及對土壤微生態(tài)系統(tǒng)的影響等方面。有研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲轉(zhuǎn)基因楊樹對非靶標(biāo)生物無明顯毒害作用、對根際土壤微生物群落無明顯影響，其節(jié)肢動物群落更穩(wěn)定、多樣[20，22，84]。也有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)抗蟲基因楊樹在殺蟲的同時，有可能會破壞局部地區(qū)的生態(tài)種群平衡，或會促使靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生抗性并遺傳。李海峰等對移栽7個月的轉(zhuǎn)Bt-蜘蛛神經(jīng)毒肽重組基因的小黑楊根際土壤微生物數(shù)量與基因水平轉(zhuǎn)移情況檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株根際土壤微生物數(shù)量略有升高，但其中有部分微生物產(chǎn)生抗生素抗性，并且有轉(zhuǎn)基因植株目的基因水平轉(zhuǎn)移到根際土壤微生物的情況發(fā)生，這一結(jié)果還須更大范圍地檢測驗證[23]。轉(zhuǎn)基因樹木的安全評估是一個長期而復(fù)雜的過程，必須進(jìn)行長期的持續(xù)跟蹤研究，才能獲得較全面的數(shù)據(jù)，以評估其大面積釋放的安全性。

2.2 耐寒轉(zhuǎn)基因楊樹研究尚在探索階段進(jìn)展緩慢

在我國北方地區(qū)，楊樹在生長過程中經(jīng)常會遇到低溫脅迫，尤其是在晚秋和早春時期，由于現(xiàn)有的許多速生豐產(chǎn)系不耐低溫，氣溫的驟然下降會對樹木產(chǎn)生極大傷害。而林業(yè)上通常使用的防寒措施，如施肥、樹干涂白也只能在一定程度上提高楊樹的抗寒能力，卻又費時費力，難以廣泛開展。因此，對楊樹進(jìn)行抗寒機制研究，從而篩選出不同抗寒能力的楊樹品種，為楊樹的適地、適樹、適品種推廣提供理論依據(jù)，對楊樹速生豐產(chǎn)林的發(fā)展意義重大。在對楊樹的轉(zhuǎn)基因和抗凍基因工程研究中，用于楊樹抗寒遺傳轉(zhuǎn)化的外源基因較少，因此，對其他林木中的抗寒相關(guān)基因進(jìn)行克隆、分離，為楊樹抗寒基因工程提供基因儲備，這些都須要進(jìn)一步深入研究。有學(xué)者將抗凍相關(guān)基因?qū)霔顦渲?，對其抗凍性還未檢測[59，61]。周洲將增加不飽和脂肪酸相關(guān)的基因（PtFAD2、PtFAD2）轉(zhuǎn)化84K楊發(fā)現(xiàn)，可以提高轉(zhuǎn)化植株三烯酸的含量，能在一定程度上改變楊樹脂肪酸組成，轉(zhuǎn)化植株在低溫脅迫下表現(xiàn)出較強耐寒能力[60]，這為楊樹的抗寒基因工程育種提供了一個新的研究方向。目前在楊樹的抗寒性研究上，對引起這些抗寒生理生化變化的分子機制研究甚少，而且通過轉(zhuǎn)基因或植入抗凍蛋白等技術(shù)來提高楊樹抗寒性的研究也較缺乏，這將會是下一步研究的重點[85]。

2.3 多基因共轉(zhuǎn)化研究初見成效

迄今為止，已有諸多遺傳轉(zhuǎn)化成功的報道，但獲得理想的轉(zhuǎn)基因楊樹并不多。究其原因，首先是自然界生物的多數(shù)性狀往往是由多基因控制的，多數(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究是將1個或2個外源基因轉(zhuǎn)入受體楊樹。對轉(zhuǎn)基因楊樹的多數(shù)性狀來說，一兩個外源基因可能因為表達(dá)強度不夠或作用機制單一，難以實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的目的，為達(dá)到培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗等性狀的品種目的，就須要把3個或更多有用基因?qū)霔顦渲羞M(jìn)行多基因操縱。夏永剛等利用基因槍共轉(zhuǎn)化法將5個外源基因[調(diào)節(jié)基因（JERF36）、枯草桿菌果聚糖蔗糖酶基因（SacB）、透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）、雙價抗蛀干害蟲基因（BtCry3A+OC-1）、報告基因（NPTⅡ）]導(dǎo)入庫安托楊，獲得含有5個外源基因的轉(zhuǎn)基因楊樹新品種，經(jīng)在鹽堿地中試驗表現(xiàn)出較強的耐鹽堿性，隨后進(jìn)行抗旱、耐澇、及生產(chǎn)能力試驗均表現(xiàn)良好，對目標(biāo)害蟲有一定抗蟲性，對昆蟲群落多樣性無明顯影響，NPTⅡ蛋白的表達(dá)量并沒有隨著目的基因數(shù)量的增加而升高，轉(zhuǎn)多個基因楊樹可能由標(biāo)記基因引起的生物安全問題并不會加劇[22，86-88]。這開創(chuàng)了多價基因同時轉(zhuǎn)入楊樹，并同時表達(dá)的實踐先河。目前尚未獲得可以大面積推廣的具有優(yōu)良基因的楊樹新品種，未來的發(fā)展方向是進(jìn)行多基因共價轉(zhuǎn)化、試圖獲得優(yōu)良的楊樹新品種。

3 楊樹轉(zhuǎn)基因研究存在問題及展望

楊樹基因的改良雖然取得了不少的成果，但在實際應(yīng)用中還存在很多困難，有很多問題亟須解決。目前楊樹基因改良的總體特征是進(jìn)行楊樹遺傳轉(zhuǎn)化體系研究的多，進(jìn)入大田栽培的品種少；進(jìn)行單個基因轉(zhuǎn)化的多，多個基因共同轉(zhuǎn)化的少，而且所選用的目的基因大都不是來自楊樹本身，多數(shù)是來源于微生物和草本植物。應(yīng)加快對楊樹本身基因組的研究，針對抗旱耐鹽、抗病蟲等關(guān)鍵抗逆性狀，開展楊樹多基因遺傳轉(zhuǎn)化研究，建立轉(zhuǎn)多基因楊樹種苗繁育、生物安全評價及管理示范體系，構(gòu)建高效、安全、快捷的林木轉(zhuǎn)基因及評價技術(shù)平臺，為我國林業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支撐。目前，我國是以美洲黑楊種質(zhì)為基礎(chǔ)的品種國產(chǎn)化育種，將楊樹產(chǎn)業(yè)種質(zhì)擴大到江淮流域，但黑楊派種質(zhì)不能很好地適應(yīng)西北干旱、半干旱地區(qū)栽種，亟須培育抗旱、抗寒、耐鹽堿能力強的楊樹品種，使我國遼闊的荒漠化日益嚴(yán)重的西北干旱、半干旱地區(qū)獲得性狀優(yōu)良的更新?lián)Q代品種。

在化石燃料急劇枯竭、溫室效應(yīng)不斷加劇的今天，楊樹作為可持續(xù)再生生物質(zhì)能源中重要的一員，可為新能源的開發(fā)利用貢獻(xiàn)力量。但其自身豐富的木質(zhì)素組成阻礙了對纖維素的降解利用，降低了生物染料產(chǎn)出，同時也增加了造紙生產(chǎn)中的污染與成本。在過去的幾十年中，研究工作者們一直致力于通過改造植株中的木質(zhì)素組成，來降低其對工業(yè)生產(chǎn)和畜牧造成的影響。能否通過改造得到自身合成易于處理或消化的木質(zhì)素的植株，成為整個纖維素利用領(lǐng)域的關(guān)鍵。2014年，一項由威斯康星大學(xué)麥迪遜分校生物化學(xué)系教授Ralph負(fù)責(zé)的研究，即從當(dāng)歸中克隆得到阿魏酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因并導(dǎo)入楊樹中，通過對木質(zhì)素取樣并使用高效液相色譜檢測，轉(zhuǎn)基因楊樹合成的木質(zhì)素中含有阿魏酸，用6.25 mmol/L NaOH在90 ℃下處理3 h后，木質(zhì)素含量就減少到滿足進(jìn)行后續(xù)工業(yè)生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)，而目前常用的處理溫度是160～200 ℃。這使進(jìn)一步改造和設(shè)計易于利用纖維素和木質(zhì)素的植物的設(shè)想成為了可能。這一研究結(jié)果為楊樹木材利用提供了新基礎(chǔ)，相信在不久的將來，木質(zhì)素降解與促進(jìn)生長相結(jié)合的轉(zhuǎn)基因楊樹在造紙工業(yè)及新能源等領(lǐng)域扮演重要角色。endprint

在全球范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)基因樹木的發(fā)展將在優(yōu)良樹種的選育、瀕危樹種保護等方面發(fā)揮更大的作用。隨著我國已繪制出毛白楊基因組序列框架，楊樹的基因改良將進(jìn)入一個新的時代，運用楊樹自身龐大豐富的優(yōu)良基因進(jìn)行多基因共價轉(zhuǎn)化，獲取性狀優(yōu)良的楊樹新品種[79]。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的進(jìn)步，各種轉(zhuǎn)化體系的建立和逐步完善，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將得到進(jìn)一步的發(fā)展，這些都為轉(zhuǎn)基因樹木的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。通過基因工程手段改造的樹木新品種，必在凈化大氣、改良土壤、恢復(fù)生態(tài)、生物質(zhì)能源及提供優(yōu)質(zhì)木材等方面發(fā)揮巨大作用。

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