余天鵬

摘要：分析了FQ-PCR方法的原理、分類、與常規(guī)病原檢測(cè)方法相比的優(yōu)缺點(diǎn)及其在豬重大病毒性疫病檢測(cè)上的應(yīng)用等，供參考。

關(guān)鍵詞：FQ-PCR；養(yǎng)豬業(yè)；應(yīng)用

中圖分類號(hào)：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X（2017）11-0029-02

近年來(lái)，我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展迅速，粗放式的散養(yǎng)模式已不能適應(yīng)現(xiàn)代社會(huì)發(fā)展的需求，2013和2014年大量散養(yǎng)戶陸續(xù)退出。未來(lái)5至10年將進(jìn)入我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的黃金時(shí)期，豬肉制品的剛性需求決定生豬產(chǎn)業(yè)具有廣闊的發(fā)展空間，在我國(guó)豬肉占國(guó)民肉類制品需求的60%以上。然而我國(guó)生豬發(fā)展的規(guī)?；图s化地區(qū)發(fā)展極不平衡，在環(huán)境保護(hù)、品種選育、動(dòng)物福利、科學(xué)與自動(dòng)化管理、疾病控制、合理用藥、食品安全領(lǐng)域嚴(yán)重落后于發(fā)達(dá)國(guó)家水平。FQ-PCR是在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上加入信號(hào)系統(tǒng)達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增的目的，繼承了傳統(tǒng)PCR高靈敏度和操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣本的定量檢測(cè)。其具有靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、線性范圍廣、過(guò)程速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。

1 FQ-PCR概述

FQ-PCR的原理是在常規(guī) PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)隨核酸產(chǎn)物的增加而等比加強(qiáng)，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度監(jiān)測(cè)核酸產(chǎn)物量的變化，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。熒光定量PCR技術(shù)采用了Ct值這一重要概念，即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小，根據(jù)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)出未知樣品的Ct值即可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出其起始拷貝數(shù)。

FQ-PCR融合了常規(guī)PCR技術(shù)與DNA探針雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程只在加樣時(shí)打開(kāi)1次反應(yīng)管，在PCR的每個(gè)循環(huán)中通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化來(lái)反映DNA鏈擴(kuò)增結(jié)果的變化，并通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行定量。FQ-PCR簡(jiǎn)便快速，靈敏度最高，可定量，抗污染能力強(qiáng)，但其成本稍高。

2 FQ-PCR分類

熒光定量標(biāo)記方法大致可分為兩大類：特異熒光標(biāo)記法和非特異性熒光標(biāo)記法。特異性熒光標(biāo)記法主要通過(guò)熒光探針和引物探針來(lái)進(jìn)行標(biāo)記， 主要包含 Taqman探針?lè)ā㈦p雜交探針和分子信標(biāo)；非特異性熒光標(biāo)記法通過(guò)在雙鏈DNA內(nèi)插式熒光染料來(lái)標(biāo)記。

3 FQ-PCR技術(shù)在豬病毒性疾病診斷中的應(yīng)用

隨著生豬規(guī)?；B(yǎng)殖的快速發(fā)展，豬傳染性疾病不斷增多，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了極大的損失。豬瘟、豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征、流行性腹瀉和傳染性胃腸炎等幾種常發(fā)疾病嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，快速、準(zhǔn)確的對(duì)病原體進(jìn)行定性定量的檢測(cè)變得尤為重要。

趙建軍等[1]應(yīng)用豬瘟病毒通用引物和野毒特異性 TaqMan探針建立了熒光定量PCR方法，可檢測(cè)到初始模板中10拷貝/μL的病毒核酸，與RT-套式PCR具有相近的敏感性。Balka等[2]建立了豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的一步實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，該方法可鑒別診斷PRRSV的所有基因型，適用于檢測(cè)和定量所有的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒株。危艷武等[3]建立了檢測(cè)PCV2的SYBR-Green熒光定量PCR方法。該方法具有很好的線性關(guān)系，對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的下限值小于10拷貝/μL。趙麗等[4]根據(jù)PRV病毒gH、gE基因的序列設(shè)計(jì)引物，建立了鑒別PRV野毒與疫苗毒感染的TaqMan探針熒光定量PCR方法。該方法對(duì)60份疑似組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與血清中和試驗(yàn)、常規(guī)PCR相比較，該方法具有快速、靈敏、特異、重復(fù)性好和能對(duì)樣品進(jìn)行定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。Kim等[5]根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）特異性核酸序列分別設(shè)計(jì)引物與探針，建立鑒別診斷TGEV和PEDV的雙重?zé)晒舛?RT-PCR 診斷方法，為診斷和定量化 TGEV 和PEDV 提供了一種特異、敏感的診斷方法，為農(nóng)場(chǎng)中豬病的有效控制提供了技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙建軍，成 丹，李 娜，等.豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的建立及其對(duì)人工感染豬體內(nèi)豬瘟病毒的檢測(cè)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007：38（7）：685-693.

[2] BALKA G，HORNYAK A，BALINT A， et al. Development of a one-step real-time quantitative PCR assay based on primer-probe energy transfer for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].J Virol Methods，2009，158（1-2）：41-45.

[3] 危艷武，劉長(zhǎng)明，袁 婧，等.實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)豬圓環(huán)病毒2型感染豬體內(nèi)病毒分布規(guī)律的研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30（12）：924-928.

[4] 趙 麗，崔保安，陳紅英，等.鑒別偽狂犬病病毒野毒與疫苗毒熒光定量PCR方法的建立[J].生物工程學(xué)報(bào)，2008，24（7）：1149-1154.

[5] KIM S H，KIM I J，PYO H M，et al. Multiplex real-time RT-PCR for the simultaneous detection and quantification of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus[J].J Virol Methods，2007，146（1-2）：172-177.endprint