唐 穎，胡小童，朱炳林，韓 宇

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 400016)

穩(wěn)定表達人α-分泌酶adam10基因啟動子熒光素酶報告基因細胞系的構建研究

唐 穎，胡小童，朱炳林，韓 宇△

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 400016)

目的構建攜帶adam10基因啟動子的熒光素酶報告載體，篩選穩(wěn)定表達細胞系并分析其活性。方法提取人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y細胞)基因組DNA，以其為模板，PCR擴增adam10基因啟動子并克隆至熒光素酶報告載體pGL4.17中，構建adam10基因啟動子熒光素酶報告載體pGL4.17-adam10，將其轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞(無啟動子的pGL4.17載體作陰性對照，帶有CMV啟動子的pGL4.51載體作陽性對照)，經(jīng)G418進行穩(wěn)定表達株的篩選，用1 μmol/L維甲酸處理細胞4 d后檢測其熒光活性。結果成功擴增到438 bp的adam10基因啟動子，pGL4.17-adam10經(jīng)PCR和雙酶切鑒定均正確。SH-SY5Y細胞被該載體轉(zhuǎn)染后經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定表達adam10基因啟動子的細胞株，經(jīng)檢測具有較強的轉(zhuǎn)錄活性；1 μmol/L維甲酸能誘導adam10基因啟動子高效表達。結論成功構建了人adam10基因啟動子熒光素酶報告載體，adam10基因啟動子在SH-SY5Y細胞中能穩(wěn)定表達，為深入研究adam10基因的表達調(diào)控、多態(tài)性分析及其高通量藥物篩選提供基礎。

去整合素和金屬蛋白酶10；啟動子；熒光素酶報告載體；高通量藥物篩選

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，近年來其發(fā)病率不斷增高?，F(xiàn)有許多證據(jù)支持淀粉樣蛋白(amyloid beta，Aβ)沉積是AD主要致病機制之一[1]。Aβ是由β-和γ-分泌酶在異常情況下水解淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)后產(chǎn)生的短肽。正常情況下，α-分泌酶水解APP產(chǎn)生可溶性且具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用的sAPPα片段，從而防止有毒性的Aβ的產(chǎn)生[2]。研究證實，去整合素和金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease 10，ADAM10)是神經(jīng)細胞生理相關的組成型APP α-分泌酶[3]，且ADAM10過表達能預防淀粉樣病變和提高長時程增強作用及學習記憶功能[4-5]。因此，α-分泌酶ADAM10被作為AD藥物潛在靶點。近年來，adam10基因多態(tài)性已在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中得到研究[6-7]，adam10基因rs653765和rs514049位點的多態(tài)性被認為可調(diào)節(jié)AD患者APP表達[8]。目前，有大量關于ADAM10與其底物相互作用的研究，針對ADAM10分子的靶向治療有望為治療AD提供新思路，然而對于ADAM10分子上游調(diào)控機制尚不清楚。本實驗通過克隆人adam10基因啟動子，構建熒光素酶報告系統(tǒng)并篩選穩(wěn)定細胞株，為進一步研究adam10基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、多態(tài)性分析及其高通量藥物篩選提供有力工具。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑 人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y細胞)為本實驗室保存；Phanta HS高保真DNA聚合酶購自Vazyme公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自NEB公司；pMD19T simple載體購自Takara公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、熒光素酶報告質(zhì)粒pGL4.17與pGL4.51、熒光素酶檢測試劑均購自Promega公司；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、脂質(zhì)體2000購自Invitrogen公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；維甲酸、二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司；感受態(tài)細胞DH5α購自北京鼎國公司；引物由上海英駿生物技術有限公司合成。其余試劑為進口分析純。

1.2方法

1.2.1人基因組模板的制備 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，采用TRIzol法提取基因組DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2adam10基因啟動子的擴增 以基因組DNA為模板，采用 Phanta HS高保真DNA聚合酶以特異性引物擴增adam10基因上游約438 bp的啟動子區(qū)，上游引物：5′-CGG GGT ACC AGC TCT CCG CCG GCG GA C-3′，下游引物5′-CCG CTC GAG TCC TCA CGG GTT AAC AGC AGC ACA T-3′，下劃線分別為KpnⅠ和XhoⅠ酶切位點。PCR反應體系為：10×PCR buffer 3.0 μL，dNTPs 1.0 μL，上下游引物各0.5 μL (10 μmol/L)，Phanta HS酶0.5 μL，基因組DNA 3.0 μL，加ddH2O補至30 μL。反應條件為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3adam10基因啟動子熒光素酶報告載體的構建 PCR產(chǎn)物回收純化后連接pMD19T simple載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，挑取氨芐青霉素篩選的陽性克隆經(jīng)PCR鑒定，鑒定正確的送測序并命名為pMD19T-adam10。以KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切pMD19T-adam10和pGL4.17質(zhì)粒，割膠回收后經(jīng)T4 DNA連接酶連接pGL4.17和adam10基因啟動子片段。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，挑取陽性克隆后用PCR及KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，PCR和雙酶切鑒定均正確的命名為pGL4.17-adam10，提取質(zhì)粒后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4細胞培養(yǎng)及穩(wěn)定表達株的篩選 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和 100 μg/mL鏈霉素的 DMEM/F12培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

將融合度約80%的SH-SY5Y細胞以6×105接種6孔板，待細胞貼壁生長至70%～80%融合度時進行轉(zhuǎn)染。用Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋載體pGL4.17-adam10(每孔5 μg)和脂質(zhì)體(每孔5 μL)，pGL4.17和pGL4.51分別作陰性、陽性對照，室溫孵育5 min，載體和脂質(zhì)體混合后室溫孵育20 min，加入到SH-SY5Y細胞中，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48 h采用1 μg/mL G418進行篩選，篩選后第14天時采用有限稀釋法克隆化，待單細胞長滿后分別轉(zhuǎn)至24、12、6孔板，10 cm培養(yǎng)皿繼續(xù)擴大培養(yǎng)(此過程需2～3個月)。得到了來自1株單克隆擴大培養(yǎng)的穩(wěn)定表達細胞株，用化學發(fā)光儀檢測其熒光活性。選取熒光強度高的進行后續(xù)實驗并命名為SH-SY5Y/pGL4.17-adam10和SH-SY5Y/pGL4.51細胞，陰性對照命名為SH-SY5Y/pGL4.17。

1.2.5維甲酸對adam10基因啟動子轉(zhuǎn)錄功能的影響 將SH-SY5Y/pGL4.17-adam10、SH-SY5Y/pGL4.17和SH-SY5Y/pGL4.51細胞以2×104接種96孔板(各5個重復孔)，生長至70%～80%融合度時加1 μmol/L維甲酸連續(xù)處理4 d，然后檢測其熒光素酶活性。

1.2.6熒光素酶活性測定 熒光素酶活性測定按照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書(Promega)進行操作。將SH-SY5Y/pGL4.17-adam10、SH-SY5Y/pGL4.17和SH-SY5Y/pGL4.51細胞以2×104接種96孔板(各5個重復孔)，培養(yǎng)24 h后每孔加與培養(yǎng)基等體積的Luciferase Reagent，輕輕混勻。室溫裂解10 min后在化學發(fā)光儀Glomax 96(Promega)中測量熒光素酶活性。

2 結 果

2.1adam10基因啟動子擴增產(chǎn)物的鑒定 提取SH-SY5Y細胞基因組DNA，以其為模板進行PCR擴增adam10基因上游長度438 bp的核心啟動子區(qū)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳可見大小約438 bp條帶，與目的片段大小相合(圖1)。PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD19T simple連接構建pMD19T-adam10，測序顯示所克隆序列無突變。

M:分子量標準;1:adam10基因啟動子樣品
圖1adam10基因啟動子PCR擴增

2.2熒光素酶報告載體pGL4.17-adam10的構建與鑒定 克隆載體pMD19T-adam10與攜帶螢火蟲熒光素酶基因的pGL4.17分別以KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收438 bp的adam10基因啟動子片段與pGL4.17載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α后菌液PCR結果表明篩選到陽性克隆。另外，pGL4.17-adam10經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ酶切后可見大小約5 600 bp(pGL4.17)與438 bp(adam10基因啟動子)的兩個片段出現(xiàn)。成功構建攜帶adam10基因啟動子的熒光素酶報告載體。見圖2。

2.3構建穩(wěn)定表達adam10基因啟動子的細胞系 在6孔板中采用pGL4.17-adam10、pGL4.17或pGL4.51對SH-SY5Y細胞進行轉(zhuǎn)染，48 h后在培養(yǎng)基中加入G418進行穩(wěn)定篩選，14 d后挑取單克隆轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中進行克隆擴大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達株SH-SY5Y/pGL4.17-adam10、SH-SY5Y/pGL4.17和SH-SY5Y/pGL4.51。

2.4穩(wěn)定表達株具有啟動活性 熒光素酶活性檢測分析表明，陰性對照SH-SY5Y/pGL4.17的熒光活性僅有4 007.0±95.4，而SH-SY5Y/pGL4.17-adam10和SH-SY5Y/pGL4.51均具有較強的熒光活性，分別是陰性對照組的(369.0±51.6)倍和(697.7±71.2)倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

A:pGL4.17-adam10載體的PCR鑒定，泳道1～3為1～3號樣品；B:pGL4.17-adam10載體的雙酶切鑒定，M為DNA marker，泳道1為adam10基因啟動子樣品1
圖2熒光素酶報告載體pGL4.17-adam10的鑒定

2.5維甲酸對adam10基因啟動子的影響 穩(wěn)定表達的3種細胞系經(jīng)1 μmol/L維甲酸處理4 d后，測定其熒光素酶活性。結果表明，相比DMSO處理組，維甲酸處理后SH-SY5Y/pGL4.17-adam10的熒光活性明顯升高(P=0.029)，但并沒有影響CMV啟動子的活性。見圖4。

3 討 論

目前對AD治療的研究均致力于開發(fā)β-和γ-分泌酶抑制劑，以抑制Aβ的產(chǎn)生[9-10]。但這兩種分泌酶除參與APP剪切外，還能剪切多種蛋白分子，比如黏附分子cadherin和Notch等，所以非特異性地抑制β-和γ-分泌酶會導致生理功能紊亂[11-15]。相反，提高α-分泌酶比如ADAM10的活性既能防止Aβ的形成，而且產(chǎn)生的sAPPα又具有神經(jīng)營養(yǎng)和保護作用。研究顯示，adam10轉(zhuǎn)基因小鼠與AD模型小鼠雜交后，其病理性斑塊顯著降低，可溶性sAPPα片段明顯升高，小鼠的學習記憶能力有所提高；相反adam10基因突變小鼠腦內(nèi)sAPPα含量降低，病理性斑塊增加[4]。因此，ADAM10的靶向治療可能成為治療AD的一種新途徑[14-15]。因此，構建攜帶人adam10基因的熒光素酶報告載體來研究adam10基因的調(diào)控和功能具有重要意義。

本實驗通過克隆人adam10基因啟動子區(qū)域，構建熒光素酶報告載體pGL4.17-adam10，并成功篩選到穩(wěn)定表達該啟動子的SH-SY5Y細胞系。SH-SY5Y/pGL4.17-adam10細胞具有較強的轉(zhuǎn)錄活性，啟動下游熒光素酶的表達，而不含啟動子的空白質(zhì)粒(pGL4.17)轉(zhuǎn)染后幾乎沒有轉(zhuǎn)錄活性。維甲酸能誘導adam10基因啟動子高效表達。

綜上所述，本實驗成功構建了人adam10啟動子驅(qū)動的熒光素酶報告載體，并建立了穩(wěn)定表達細胞株，既可用于研究adam10基因的表達調(diào)控，也可用于多態(tài)性分析及其高通量藥物篩選，為將來篩選有效的AD藥物奠定基礎。

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ConstructionofSH-SY5Ycelllinestablyexpressinghumanα-secretaseadam10genepromoterluciferasereportergene

TangYing,HuXiaotong,ZhuBinglin,HanYu△

(DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

ObjectiveTo construct the luciferase report vector carrying a disintegrin and metalloprotease 10(adam10) gene promoter,to screen its stable expression cell line and to analyze its activity.MethodsThe genome DNA of human neuroblastoma SH-SY5Y cells was extracted as the template.Theadam10 gene promoter was amplified by PCR and was cloned into luciferase reporter vector pGL4.17.Theadam10 gene promoter luciferase reporter vector pGL4.17-adam10 was constructed and transfected in to SH-SY5Y cells(pGL4.17 vector without promotoer as the negative control and pGL4.17 vector with CMV promoter as the positive control).Then the stable expression cell line was screened by G418 and its fluorescence activity was detect after treating with 1 μmol/L retinoic acid(RA) for 4 d.ResultsAbout 438 bpadam10 gene promoter was successfully amplified by PCR.The pGL4.17-adam10 vector was correct by PCR and double enzyme digestion identification.The cell line stably expressingadam10 gene promoter was obtained after transfecting SH-SY5Y cells by this vector and screening by G418,which had stronger transcriptional activity by detection;1 μmol/L RA could induce high efficiency expression ofadam10 gene promoter.ConclusionHumanadam10 gene promoter luciferase vector is successfully constructed.adam10 gene promoter can be stably expressed in SH-SY5Y cells,which provides a basis for deeply studyingadam10 gene expression regulation,polymorphism analysis and high-throughput drug screening.

a disintegrin and metalloprotease 10;promoter;luciferase reporter vector;high-throughput drug screening

唐穎(1992-)，在讀碩士，主要從事阿爾茨海默病發(fā)病機制研究?！?/p>

，E-mail:hany96@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.020

Q291

A

1671-8348(2017)28-3947-03

2017-04-16

2017-05-22)