于浩，張海悅，李震，楊雪（長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林長春130012）

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鹿骨雙酶法酶解工藝的研究

于浩，張海悅*，李震，楊雪
（長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林長春130012）

摘要：以新鮮鹿骨為原料，探討鹿骨酶解的最佳工藝條件；以水解度為指標，確定以堿性蛋白酶和胰蛋白酶為試驗用酶，通過正交試驗確定鹿骨雙酶法酶解的最佳工藝條件。結果表明：堿性蛋白酶在pH 9.0、溫度50℃的條件下水解時間為3 h，再在pH 8.0、溫度37℃條件下，加入胰蛋白酶水解2 h，此時的水解度為12.72%，分別是堿性蛋白酶和胰蛋白酶最大水解度的1.84倍和1.39倍。

關鍵詞：鹿骨；雙酶；水解度；工藝

動物藥是中藥三大來源之一，資源廣，療效強，但因動物藥在常用中藥中僅占1/10［1-2］，故其研究深度遠遠落后于植物藥。梅花鹿是動物藥之首，臨床使用量大，療效確切。鹿骨是鹿的骨骼，具有補腎壯陽、益氣補血、祛風除濕功能，對久病體弱、精髓不足、貧血、風濕、四肢疼痛等癥有較好的臨床療效［3-5］?？梢娐构遣粌H營養(yǎng)價值很高，含有大量的人體所需的營養(yǎng)保健物質，而且可治療多種疾病如骨質增生，-OH自由基清除［6］。還含有大量膠原蛋白，約占57%，還有磷脂質、糖蛋白、維生素，多種礦物質元素如鈣、鎂、鐵、鋅、鉀、銅等，鹿骨的軟骨中還富含大量的酸性粘多糖及其衍生物，具有重要的生理功能和多種藥理活性［3，7］。長春市雙陽區(qū)作為中國鹿鄉(xiāng)，有成規(guī)模的養(yǎng)殖場，先后開發(fā)出鹿血酒，鹿胎膏，人參鹿血粉等一系列產(chǎn)品，但鹿骨作為附產(chǎn)品，其附加值還很低，鹿骨的開發(fā)利用，也是增加養(yǎng)鹿企業(yè)經(jīng)濟效益的有效途徑之一。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

胃蛋白酶（3 000 N.F.U/mg）：合肥新安原生物科技有限公司；胰蛋白酶（250 N.F.U/mg）：合肥新安原生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（6 000 U/mg）：北京博奧拓達科技有限公司；中性蛋白酶（130 000 U/mg）：上?；菔郎噭┯邢薰?；堿性蛋白酶（100 000 U/mg）：上?；菔郎噭┯邢薰?。

試驗用新鮮鹿骨：由長春世鹿鹿業(yè)有限公司提供，其余試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

DF-101S集熱式攪拌器：金壇市科析儀器有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；FW135中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-3C型精密pH計：上海虹益儀器儀表有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1工藝流程［8-9］

新鮮鹿骨→預處理→高壓蒸煮→去除骨髓→一次干燥→粗粉碎→酶處理→二次干燥→冷卻→微粉碎→滅菌包裝

1.3.2操作要點

1）預處理：清水洗凈鹿骨，剔除殘留肉、筋、骨膜等非骨成分；

2）高壓蒸煮：0.1 MPa高壓蒸煮3 h，65℃恒溫干燥6 h；

3）粗粉碎：將干燥后的鹿骨進行粗粉碎，粒徑1 cm～2 cm；

4）酶處理：用堿性蛋白酶在pH 9.0、50℃條件下水解3 h，高溫滅酶，調至pH 8.0、37℃條件下，加入胰蛋白酶水解2 h；

5）二次干燥：經(jīng)酶處理后的骨粉在70℃、5 h條件下干燥；

6）微粉碎：經(jīng)微粉碎機粉碎后，粒徑過300目篩。

1.3.3單酶的選擇

以粗粉碎后的鹿骨為底物，分別用胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，在各自最適溫度、最適pH下進行水解試驗，比較各酶對鹿骨蛋白的水解度。

1.3.4單酶水解單因素試驗

單因素試驗是以鹿骨蛋白的水解度為評價指標，分別研究酶底比、pH、溫度、時間對水解度的影響。圖1至圖6為單因素試驗結果圖。

1.3.5單酶的正交優(yōu)化試驗

在1.3.4研究結果的基礎上，為確定兩種酶分別單獨使用時的最佳水解條件，選擇酶底比、pH、溫度、時間對這兩種單酶分別做四因素三水平正交試驗，表2、表3分別為堿性蛋白酶和胰蛋白酶的正交因素表，表4、表5分別為兩者的正交結果表。

1.3.6雙酶組合法酶解試驗

組合1：同時加入堿性蛋白酶和胰蛋白酶，在37℃、pH8.0條件下酶解5 h，測定鹿骨蛋白的水解度；

組合2：同時加入堿性蛋白酶和胰蛋白酶，在50℃、pH9.0條件下酶解5 h，測定鹿骨蛋白的水解度；

組合3：先將胰蛋白酶37℃、pH8.0酶解2 h后，再加入堿性蛋白酶50℃、pH9.0酶解3 h，測定鹿骨蛋白的水解度；

組合4：先將堿性蛋白酶50℃、pH9.0酶解3 h后，再加入胰蛋白酶37℃、pH8.0酶解2 h，測定鹿骨蛋白的水解度。雙酶組合法酶解的結果如表6所示。

1.3.7總氮含量測定

凱氏定氮法，參照GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》。

1.3.8游離氨基態(tài)氮的測定

甲醛電位滴定法，參照GB 5009.39-2003《醬油衛(wèi)生標準的分析方法》。

1.3.9水解度的測定

水解度DH表示原料蛋白質中肽鍵被裂解的百分數(shù)，即蛋白質被酶催化水解的程度［10］，水解度按公式（1）計算：

式中：DH為水解度，%；N0為樣品總氮含量，%；N1為酶解前游離氨基態(tài)氮含量，%；N2為酶解后游離氨基態(tài)氮含量，%。

2　結果與分析

2.1單酶的選擇

單酶水解效果對比試驗如表1所示。

表1　單酶水解效果對比試驗Table 1 Hydrolysis effect contrast test of single enzyme

根據(jù)（GB 5009.5-2010）凱式定氮法，測得鹿骨中蛋白含量為26.2%。

由表1可知，在5種常用蛋白酶各自最適條件下，鹿骨水解效果最好的是胰蛋白酶和堿性蛋白酶，兩者的水解度分別為8.74%和6.98%。但這一結果與袁永俊等的結果有所不同。袁永俊等發(fā)現(xiàn)在魚肉蛋白酶解時，胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解效果較好［10］。這可能是由于魚肉蛋白在人體中的消化場所主要在胃部，其最適的環(huán)境為酸性；而鹿骨蛋白的水解卻需要在堿性條件下所導致的。

2.2單因素結果分析

2.2.1酶底比對水解度的影響

酶底比對水解度的影響如圖1所示。

圖1　酶底比對水解度的影響Fig.1 Effect of the ratio of enzyme to substrate on hydrolysis degree

由圖1可知，隨著酶底比的增加，酶與底物的接觸幾率更大，酶解時水解度快速上升，堿性蛋白和胰蛋白酶在酶底比為1∶80時上升速率最高；但隨著水解反應進行，鹿骨蛋白的水解度趨于平穩(wěn)，酶底比達到1∶100之后趨于平穩(wěn)，說明已經(jīng)達到酶的最大水解能力。綜合考慮，堿性蛋白酶和胰蛋白酶的最佳酶底比均為1∶100。

2.2.2pH對水解度的影響

pH對堿性蛋白酶水解度的影響如圖2所示；pH對胰蛋白酶水解度的影響如圖3所示。

圖2　pH對堿性蛋白酶水解度的影響Fig.2 Effect of pH value on Alkaline hydrolysis

圖3　pH對胰蛋白酶水解度的影響Fig.3 Effect of pH value on Trypsin hydrolysis

由圖2、圖3可知，酶在最適pH范圍內對水解效果的影響較小，偏離最適pH范圍則影響較大。pH影響酶的穩(wěn)定性，對水解反應影響較大，堿性蛋白酶在pH 9.0左右時，鹿骨蛋白的水解度最大為6.33%，胰蛋白酶在pH 8.0左右時，鹿骨蛋白的水解度最大為7.45%。且由圖形可見，堿性蛋白酶的pH范圍要相對較寬，說明在最適pH附近的酸堿環(huán)境，堿性蛋白酶依然可以發(fā)揮酶解作用。綜上所述，選擇pH為9.0和8.0作為堿性蛋白酶和胰蛋白酶的最適pH。

2.2.3時間對水解度的影響

時間對水解度的影響如圖4所示。

由圖4可知，隨著時間的增加，水解度先呈大幅上升趨勢；但當水解度接近最大值時，隨著時間的增加，水解能力增加的速度逐漸趨向平緩，這可能是由于隨著水解的進行，酶的酶解能力已經(jīng)達到飽和。綜合考慮效率和時間成本，堿性蛋白酶和胰蛋白酶的水解時間分別為3 h和2 h。

2.2.4溫度對水解度的影響

溫度對堿性蛋白酶水解度的影響如圖5所示；溫度對胰蛋白酶水解度的影響如圖6所示。

圖4　時間對水解度的影響Fig.4 Effect of time on hydrolysis degree

圖5　溫度對堿性蛋白酶水解度的影響Fig.5 Effect of temperature on alkaline hydrolysis

圖6　溫度對胰蛋白酶水解度的影響Fig.6 Effect of temperature on trypsin hydrolysis

由圖5、圖6可知，溫度對水解度的影響較為明顯，在一定范圍內隨反應溫度升高，水解度增加，但超過一定溫度之后，水解度呈下降趨勢，這是由于隨著溫度變高，酶中的蛋白質開始變性，導致酶的活性降低，酶解效率也隨之降低，故堿性蛋白酶的最適溫度選擇為45℃，胰蛋白酶的最適溫度選擇為37℃。

2.3兩種酶水解條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗的結果，分別以pH、溫度、時間、酶底比這4個因素做正交試驗。表2、表3分別為堿性蛋白酶和胰蛋白酶的因素水平表，兩者的正交試驗結果分別如表4、表5所示。

表2　堿性蛋白酶正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levers of orthogonal experimental design of alkaline

表3　胰蛋白酶正交試驗因素水平表Table 3 Factors and levers of orthogonal experimental design of trypsin

表4　堿性蛋白酶正交試驗結果表Table 4 The results and analysis of orthogonal experiment of alkaline

表5　胰蛋白酶正交試驗結果表Table 5 The results and analysis of orthogonal experiment of trypsin

由表4可知，極差R是B＞C＞A＞D，也就是說，影響堿性蛋白酶水解度的主次因素是pH＞溫度＞酶底比＞水解時間。從K值中可知，堿性蛋白酶水解的最佳組合為A3B2C2D2，即酶底比為1∶120（質量比），pH為9.0，溫度為50℃，水解時間為3 h，驗證試驗發(fā)現(xiàn)此條件下鹿骨的水解度為6.92%。而正交試驗中的最佳組合為A1B2C2D2，該條件下鹿骨的水解度為6.53%。因此，正交優(yōu)化出來的組合水解能力要大于實際的最優(yōu)值，故選取正交優(yōu)化出的數(shù)據(jù)組合。

由表5可知，極差R是B＞C＞D＞A，也就是說，影響胰蛋白酶水解度的主次因素是pH＞溫度＞水解時間＞酶底比。從K值中可知，胰蛋白酶水解的最佳組合為A3B2C2D2，即酶底比1∶120（質量比），pH為8.0，溫度為37℃，水解時間為2 h，驗證試驗發(fā)現(xiàn)此條件下鹿骨的水解度為9.12%。而正交試驗中的最佳組合為A2B2C3D1，該條件下鹿骨的水解度為8.63%。因此，正交優(yōu)化出來的組合水解能力要大于實際的最優(yōu)值，故也選取正交優(yōu)化出的數(shù)據(jù)組合。

由上述驗證試驗可知，胰蛋白酶和堿性蛋白酶在正交優(yōu)化出的最佳條件下，胰蛋白酶的最大水解能力仍然要強于堿性蛋白酶的水解能力，為后者的1.32倍。

2.4雙酶組合對水解度的影響

雙酶組合酶解試驗如表6所示。

表6　雙酶組合酶解試驗Table 6 Double enzyme hydrolysis test combination

1）如表6中所示，雙酶法的水解能力總體上是優(yōu)于單酶法的。且將堿性蛋白酶在50℃、pH9.0酶解3 h后，再加入胰蛋白酶在37℃、pH8.0酶解2 h，該方法下鹿骨的水解度最大，可達到12.72%，分別是單獨使用堿性蛋白酶和胰蛋白酶最大水解度的1.84倍和1.39倍。

2）組合1的水解能力要優(yōu)于組合2。原因在于組合1中37℃、pH8.0的條件，未達到堿性蛋白酶的最佳酶解條件，此時堿性蛋白酶的活性未得到完全激發(fā)，但仍具備一定的水解能力；而組合2中50℃、pH 9.0的條件，已超過胰蛋白酶的最佳酶解條件，此時胰蛋白酶的活性已經(jīng)開始部分失活，造成其水解的能力要低于前者。組合4的水解度盡管是最大的，但相對于組合3來說，優(yōu)勢并非很明顯，也很有可能是上述原因造成的。

3　結論

1）在相同條件下，5種常用蛋白酶的水解效果，胰蛋白酶和堿性蛋白酶對鹿骨的水解效果要優(yōu)于其他3種酶。

2）胰蛋白酶和堿性蛋白酶單獨使用時，正交試驗優(yōu)化出來的最佳條件分別是：堿性蛋白酶在酶底比為1∶120（質量比），pH為9.0，溫度為50℃，水解時間為3 h后，鹿骨的水解度為6.92%；胰蛋白酶在酶底比1∶120（質量比），pH為8.0，溫度為37℃，水解時間為2 h，鹿骨的水解度為9.12%，為前者的1.32倍。

3）雙酶法的水解能力總體上是優(yōu)于單酶法的。且將堿性蛋白酶在50℃、pH9.0酶解3 h后，再加入胰蛋白酶在37℃、pH8.0酶解2 h，該方法下鹿骨的水解度最大，可達到12.72%，分別是單獨使用堿性蛋白酶和胰蛋白酶最大水解度的1.84倍和1.39倍。

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The Research of the Enzymolysis of Deer Bone Meal Using Double-enzyme Hydrolysis

YU Hao，ZHANG Hai-yue*，LI Zhen，YANG Xue
（Chemistry and Life Science College，Changchun University of Technology，Changchun 130012，Jilin，China）

Abstract：Fresh deer bones were used as raw materials to find the optimal conditions to enzymolysis deer bone. Taking degree of hydrolysis as index，alkaline protease and trypsin were chosen as the two tool enzymes. Based on orthogonal experiment，the optimum conditions of double-enzyme hydrolysis was conducted. The results showed that the optimum conditions of enzymatic hydrolysis was alkaline protease at pH 9.0，50℃for 3 hours and then trypsin at 37℃，pH 8.0 for another 2 hours，the hydrolysis degree could be reached 12.72%.Compared with those of hydrolyzing with alkaline protease and trypsin alone，hydrolysis degree were 1.84 times and 1.39 times，respectively.

Key words：deer bone；double-enzyme；hydrolysis degree；technology

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.019

作者簡介：于浩（1990—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的提取。

*通信作者

收稿日期：2015-03-17