金科華,張惠敏,楊志珅,金天穎,盧曉曉

(1湖北科技學院醫(yī)藥研究院,咸寧 437100;2湖北科技學院基礎(chǔ)醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所;3湖北科技學院基礎(chǔ)醫(yī)學院)

BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒電泳彌散原因初探

金科華1,2,張惠敏3,楊志珅3,金天穎3,盧曉曉3

(1湖北科技學院醫(yī)藥研究院,咸寧 437100;2湖北科技學院基礎(chǔ)醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所;3湖北科技學院基礎(chǔ)醫(yī)學院)

目的 探討TaKaRa公司(中國大連)快速限制酶BamHⅠ+XhoⅠ 37 ℃雙酶切質(zhì)粒pET-28a、pET-28a-SDHA產(chǎn)生彌散的原因。 方法 比較4種條件下酶切對彌散的影響:①BamHⅠ+XhoⅠ 37 ℃雙酶切Elution Buffer(EB)洗脫或水洗脫的質(zhì)粒;②NdeⅠ+XhoⅠ 37 ℃雙酶切EB洗脫或水洗脫的質(zhì)粒;③先BamHⅠ 30 ℃酶切,再XhoⅠ 37 ℃酶切;④BamHⅠ分別于30 ℃、37 ℃單酶切。 結(jié)果 ①BamHⅠ+XhoⅠ 37 ℃雙酶切EB或水洗脫的質(zhì)粒均產(chǎn)生嚴重彌散;②NdeⅠ+XhoⅠ 37 ℃雙酶切EB洗脫或水洗脫的質(zhì)粒無彌散;③BamHⅠ 30 ℃酶切+XhoⅠ 37 ℃酶切,無彌散;④BamHⅠ 30 ℃單酶切無彌散,37 ℃單酶切嚴重彌散。 結(jié)論BamHⅠ+XhoⅠ 37 ℃酶切質(zhì)粒電泳彌散是BamHⅠ在此溫度下的星活性所致。

BamHⅠ; 雙酶切; 彌散; 星活性

雙酶切鑒定是判斷DNA重組成功與否的重要方法[1-4]。限制酶在高pH、低離子強度、不合適的金屬輔因子[5]、有機溶劑、高甘油濃度[6]條件下酶切易產(chǎn)生星活性,干擾鑒定結(jié)果的判讀。然而,反應(yīng)溫度對限制酶星活性的影響鮮見報道。雙酶切鑒定含琥珀酸脫氫酶亞基A(SDHA)cDNA(1995bp)的重組質(zhì)粒pET-28a-SDHA(下稱28a-SDHA)時,發(fā)現(xiàn)BamHⅠ 37 ℃酶切時出現(xiàn)強星活性,導(dǎo)致產(chǎn)物彌散,而30 ℃酶切時,彌散消除,現(xiàn)予以報道。

1 材料與方法

1.1 DNA和主要試劑

重組質(zhì)粒28a-SDHA,28a-AMY1A(AMY1A,唾液淀粉酶A)為前期構(gòu)建(插入pET-28a的BamHⅠ、XhoⅠ位點間)。質(zhì)粒提取試劑盒、50×TAE購自生工生物工程(上海)股份有限公司?？焖傧拗菩詢?nèi)切酶及10×DNA Loading Buffer購自TaKaRa(大連)公司。

1.2 實驗思路

為探索BamHⅠ+XhoⅠ 37 ℃雙酶切質(zhì)粒電泳彌散的原因,比較4個條件對彌散的影響:①不同溶液洗脫的質(zhì)粒;②不同的限制酶組合雙酶切;③不同溫度分步雙酶切;④同一酶不同溫度單酶切。

1.3BamHⅠ+XhoⅠ 37 ℃雙酶切EB洗脫、水洗脫的質(zhì)粒

按上述步驟抽提質(zhì)粒,換用60 μl超純水洗脫質(zhì)粒。按1.2雙酶切、電泳。

1.4NdeⅠ+XhoⅠ 37 ℃雙酶切EB、水洗脫的質(zhì)粒

按1.3抽提質(zhì)粒,將BamHⅠ更換為NdeⅠ,按1.3雙酶切、電泳。

1.5BamHⅠ 30 ℃單酶切+XhoⅠ 37 ℃單酶切

取1.3 EB洗脫的質(zhì)粒,BamHⅠ單酶切:28a(或28a-SDHA)6 μl+H2O 6.5 μl+BamHⅠ 1 μl+10×Buffer 1.5 μl,30 ℃酶切15 min。將反應(yīng)管置65 ℃熱滅活20 min,冰浴冷卻。加10×Buffer 0.5 μl、XhoⅠ 1μl、H2O 3.5 μl,37 ℃酶切15 min。加3 μl 10×LBuffer終止反應(yīng),電泳檢測。

1.6BamHⅠ 30 ℃、37 ℃分步單酶切

取1.3的質(zhì)粒兩份,一份30 ℃單酶切:28a(或28a-SDHA)6 μl+H2O 11 μl+BamHⅠ 1 μl+10×Buffer 2 μl,30 ℃酶切15 min;另一份,按相同酶切體系37 ℃酶切15 min。加3 μl 10×LBuffer 終止反應(yīng),電泳。

以上實驗均為3次生物學重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1BamHⅠ+XhoⅠ 37 ℃雙酶切EB、水洗脫質(zhì)粒均出現(xiàn)嚴重彌散

質(zhì)粒28a(5 369 bp)經(jīng)BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切應(yīng)出現(xiàn)一條約5 300 bp的條帶;28a-SDHA應(yīng)出現(xiàn)約5 300 bp、約1 995 bp的帶各1條。EB洗脫的28a、28a-SDHA經(jīng)BamHⅠ+XhoⅠ 37 ℃雙酶切后未出現(xiàn)上述條帶,代之以嚴重的彌散(圖1的 1,2泳道)。鹽離子濃度會影響限制酶的活性,EB中含有一定量的鹽離子,為排除其對酶活性的影響,以超純水取代EB洗脫抽提的質(zhì)粒,隨后酶切。電泳顯示BamHⅠ+XhoⅠ 37 ℃酶切水洗脫的質(zhì)粒出現(xiàn)

與EB洗脫相似程度的彌散(圖1的3,4泳道)?？梢?彌散與洗脫質(zhì)粒所用溶液無關(guān)。

M1.DL15000 DNA Marker; M2.Trans2K DNA Marker; 1, 2.分別為BamHⅠ+Xho Ⅰ 37 ℃酶切EB洗脫的28a, 28a-SDHA; 3,4.分別為BamHⅠ+Xho Ⅰ 37 ℃酶切水洗脫的28a, 28a-SDHA圖1 電泳檢測BamHⅠ+Xho Ⅰ 37 ℃酶切EB、水洗脫質(zhì)粒的產(chǎn)物Figure 1 Electrophoresis of product of plasmids eluted by EB or water and digested with BamHⅠ and Xho Ⅰ at 37 ℃

2.2NdeⅠ+XhoⅠ 37 ℃雙酶切EB、水洗脫的質(zhì)粒產(chǎn)物未出現(xiàn)彌散

XhoⅠ最適溫度為37 ℃,彌散不可能是其37 ℃酶切產(chǎn)生的星活性所致。BamHⅠ使用說明書指出BamHⅠ在37 ℃酶切時具有與30 ℃相似的活性,但不夠穩(wěn)定。為此,推測彌散可能與BamHⅠ 37 ℃酶切產(chǎn)生的星活性有關(guān)。28a的多克隆位點中,NdeⅠ位點(不存在于SDHA cDNA中)位于BamHⅠ上游36 bp處,其最適溫度為37 ℃。改用NdeⅠ+XhoⅠ酶切鑒定重組質(zhì)粒。結(jié)果顯示,無論EB洗脫還是水洗脫的28a和28a-SDHA,酶切產(chǎn)物均未出現(xiàn)彌散;載體大片段(綠色箭頭示)和SDHA小片段(紅色箭頭示)分子量與理論值相符(圖2A)。據(jù)圖1、圖2結(jié)果,初步推斷彌散是BamHⅠ 37 ℃產(chǎn)生的星活性所致。

2.3BamHⅠ、XhoⅠ不同溫度分步酶切質(zhì)粒未出現(xiàn)彌散

為進一步證實2.3的推斷,按1.5先BamHⅠ 30 ℃酶切,再XhoⅠ 37 ℃酶切。結(jié)果顯示,酶切產(chǎn)物未出現(xiàn)彌散,載體大片段(綠色箭頭示)和SDHA小片段(紅色箭頭示)清晰可見,分子量正確(圖3)。可見,彌散確為BamHⅠ 37 ℃酶切產(chǎn)生的星活性所致。

M.1 kb DNA Ladder;1,2.分別為Nde Ⅰ+Xho Ⅰ 37 ℃酶切EB洗脫的28a, 28a-SDHA;3,4.分別為Nde Ⅰ+Xho Ⅰ 37 ℃酶切水洗脫的28a, 28a-SDHA圖2 電泳檢測Nde Ⅰ+Xho Ⅰ 37 ℃酶切EB、水洗脫質(zhì)粒的產(chǎn)物Figure 2 Electrophoresis of product of plasmids eluted by EB or water and digested with Nde Ⅰ plus Xho Ⅰ at 37 ℃

M.1 kb DNA Ladder;1,2.分別為BamHⅠ 30 ℃+Xho Ⅰ 37 ℃酶切EB洗脫的28a, 28a-SDHA圖3 電泳檢測BamHⅠ 30 ℃+Xho Ⅰ 37 ℃酶切質(zhì)粒的產(chǎn)物Figure 3 Electrophoresis of product of plasmids digested with BamHⅠ at 30 ℃ plus Xho Ⅰ at 37 ℃

2.4BamHⅠ 30 ℃單酶切無彌散、37 ℃單酶切彌散嚴重

為佐證彌散由BamHⅠ的星活性所致,按1.6對質(zhì)粒進行BamHⅠ單酶切。結(jié)果顯示,30 ℃酶切未出現(xiàn)彌散;37 ℃酶切嚴重彌散(見圖4),但較之BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切明顯減輕?？梢?彌散為BamHⅠ在37 ℃的星活性所致,且XhoⅠ與之雙酶切加重彌散。

3 討論

瓊脂糖凝膠電泳彌散與陳舊的電泳緩沖液、過高的電壓及不正確的酶切體系有關(guān)。本文所用電泳緩沖液均新鮮配制,每電泳5次即行更換,故彌散與電泳緩沖液無關(guān);所用電場強度6 V/cm,在合理范圍內(nèi),故可排除電場強度對彌散的影響。據(jù)此推測,彌散源自不正確的酶切導(dǎo)致的星活性。

M.1 kb DNA Ladder; 1, 2.分別為BamHⅠ 30 ℃酶切28a、28a-SDHA的產(chǎn)物; 3,4.分別為BamHⅠ 37 ℃酶切28a、28a-SDHA的產(chǎn)物圖4 BamHⅠ不同溫度酶切對彌散的影響Figure 4 The effect of BamHⅠ digestion at different temperatures on smear

導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生星活性的因素眾多,如錯誤的緩沖液、酶切時間過長、酶切體系甘油濃度過高等。限制酶緩沖液均經(jīng)過廠家反復(fù)優(yōu)化,使用廠家推薦的緩沖液,限制酶均能達到100%活性,本文使用推薦的緩沖液;酶切時間短(15 min);酶切體系甘油濃度為5%。故本實驗出現(xiàn)的星活性與上述因素無關(guān)。為此,推測彌散可能是酶切溫度不當出現(xiàn)的星活性所致。

BamHⅠ使用說明書指出:BamHⅠ最適酶切溫度為30 ℃,在37 ℃也具有極高活性,但不夠穩(wěn)定?！安粔蚍€(wěn)定”易被理解為活性時高時低,不易被理解為出現(xiàn)星活性,導(dǎo)致酶切產(chǎn)物彌散,故此描述不易引起重視。加之雙酶切省時省力,科研人員常忽略這種含糊的描述,直接與其他最適溫度為37 ℃的酶于37 ℃雙酶切。如此酶切易出現(xiàn)彌散,而不以為然。標準條件下BamHⅠ識別的經(jīng)典序列為GGATCC[8];非標準條件下識別經(jīng)典序列的概率極大降低,識別非經(jīng)典序列GGAACC、GGCTCC、GAATCC和GGATCN[9]的概率升高。非經(jīng)典序列在28a內(nèi)出現(xiàn)的次數(shù)分別為2，1，0，8,在SDHA cDNA內(nèi)出現(xiàn)的次數(shù)分別為1，1，0，8,累計在28a-SDHA內(nèi)出現(xiàn)21次,為此在37 ℃酶切產(chǎn)生彌散不難理解。

BamHⅠ 37 ℃酶切出現(xiàn)星活性并非偶然現(xiàn)象。平行抽提、酶切的重組質(zhì)粒28a-AMY1A,出現(xiàn)與28a-SDHA類似的彌散(結(jié)果未列)。

BamHⅠ 37 ℃單獨酶切的彌散程度低于與XhoⅠ雙酶切,可見兩種最佳酶切溫度不同的限制酶在其中一種酶的最佳溫度下雙酶切,處于最適溫度的酶會加重非最適溫度酶的星活性,其機制有待研究。

總之,本文發(fā)現(xiàn)BamHⅠ+XhoⅠ 37 ℃雙酶切的質(zhì)粒電泳彌散的原因是BamHⅠ出現(xiàn)的星號活性。

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PreliminaryexplorationonthecausesofplasmidsmearproducedbydoubledigestionwithBamHⅠandXhoⅠ

JIN Kehua1,2,ZHANG Huimin3,YANG Zhishen3,JIN Tianying3,LU Xiaoxiao3

(1MedicineResearchInstitute,HubeiUniversityofScienceandTechnology,Xianning437100,China;2BasicMedicineResearchInstitue,BasicMedicalCollege,HubeiUniversityofScienceandTechnology;3BasicMedicalCollege,HubeiUniversityofScienceandTechnology)

ObjectiveTo explore the causes of the smear of plasmids(pET-28a and pET-28a-SDHA), doubly digested byBamHⅠ andXhoⅠ(Takara, Dalian, China)at 37 ℃.MethodsThe effects of plasmid digestion under four conditions on smear were compared. First,BamHⅠ andXhoⅠ codigested plasmids eluted by elution buffer(EB) or water at 37 ℃. Second,NdeⅠ andXhoⅠ codigested plasmids at 37 ℃. Third, plasmids were digested byBamHⅠ at 30 ℃ and followed byXhoⅠ at 37 ℃. Fourth, plasmids were digested byBamHⅠ at 30 ℃ or 37 ℃.ResultsThe serious smear appeared in plasmids after eluted by EB or water, and digested byBamHⅠ andXhoⅠ at 37 ℃. But the smear did not appear in the above-mentioned plamids digested by Nde Ⅰ andXhoⅠ at 37 ℃, or byBamHⅠ at 30 ℃ plusXhoⅠ at 37 ℃. What’s more, the smear did not appear in plasmids digested byBamHⅠ at 30 ℃, but did when digested at 37 ℃.ConclusionThe smear of plasmids doubly digested byBamHⅠ andXhoⅠ at 37 ℃ is caused by the star activity ofBamHⅠ digestion at 37 ℃.

BamHⅠ; double digestion; smear; star activity

湖北科技學院校級科研基金資助項目(KY2014074)

金科華,男,1978-12生,博士,講師,E-mail:striveapple@126.com

2017-07-08

Q503

A

1007-6611(2017)11-1114-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.11.006