羅雨婷++吳寶森++谷大海++徐志強++王桂瑛++王雪峰++范江平++普岳紅++汪善榮++廖國周

摘 要：通過提取不同加工年份的諾鄧火腿粗肽，測定其多肽含量、平均肽鏈長度（average peptide chain length，APCL）以及多肽的分子質量分布，對多肽的特征進行分析，同時測定不同加工年份諾鄧火腿粗肽的游離氨基酸組成及脂質、蛋白質氧化抑制活性。結果表明：加工2 年諾鄧火腿粗肽的多肽含量顯著高于其他2 個加工年份

（P<0.05）；加工1 年、2 年和3 年諾鄧火腿粗肽的APCL及平均分子質量沒有顯著差異（P>0.05）；加工1 年、2 年火腿粗肽的各類游離氨基酸含量顯著高于加工3 年的火腿（P<0.05）；加工1 年、2 年和3 年的諾鄧火腿粗肽的脂質氧化抑制率在144 h分別達到了77.95%、76.79%和75.45%，與谷胱甘肽（glutataione，GSH）的抑制效果（64.32%）存在極顯著差異（P<0.01）；加工1 年和2 年諾鄧火腿粗肽的蛋白質氧化抑制能力比加工3 年的諾鄧火腿更好，且存在極顯著差異（P<0.01）。

關鍵詞：諾鄧火腿；加工年份；多肽特征；抗氧化活性

Peptide Characteristics and Antioxidant Properties of Nuodeng Hams of Different Ages

LUO Yuting1，2， WU Baosen1，2， GU Dahai1，2， XU Zhiqiang1，2， WANG Guiying1，2， WANG Xuefeng1，2， FAN Jiangping1，2，

PU Yuehong1，2， WANG Shanrong3，*， LIAO Guozhou2，*

（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China；

2.Livestock Product Processing Engineering and Technology Research Center of Yunnan Province， Kunming 650201， China；

3.Yunnan Rural Leader College， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China）

Abstract： This study determined the peptide content， average peptide chain length （APCL）， molecular mass distribution and free amino acid content of crude peptides extracted from Nuodeng hams of different ages. Additionally， the inhibitory effect of the extracted peptides on protein and lipid oxidation was evaluated. The results obtained showed that crude peptides were significantly more abundant in 2-year-old ham than in those of two other ages （P < 0.05）. No significant differences in the APCL and average molecular mass of crude peptides from one-， two- and three-year-old ham samples （P > 0.05）. The contents of various free amino acids in crude peptides from one- and two-year-old hams was significantly increased as compared to the older one （P < 0.05 ）. The percentage inhibition of lipid oxidation after 144 h incubation in the presence of crude peptides from one-， two- and three-year-old ham samples reached 77.95%， 76.79% and 75.45%， respectively， with a highly significant difference being observed compared with that （64.32%） obtained with glutataione （GSH） （P < 0.01）. Crude peptides from one- and two-year-old hams had a significantly stronger capacity to inhibit protein oxidation that those from three-year-old ham （P < 0.01）.

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709006

Key words： Nuodeng ham； age； peptide characteristics； antioxidant properties

中圖分類號：TS251.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）09-0032-06endprint

引文格式：

羅雨婷， 吳寶森， 谷大海， 等. 不同加工年份諾鄧火腿粗肽的特征與抗氧化活性[J]. 肉類研究， 2017， 31（9）： 32-37. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709006. http：//www.rlyj.pub

LUO Yuting， WU Baosen， GU Dahai， et al. Peptide characteristics and antioxidant properties of nuodeng hams of different ages[J]. Meat Research， 2017， 31（9）： 32-37. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709006. http：//www.rlyj.pub

在干腌火腿長時間的加工過程中會發(fā)生一系列生物化學反應，并形成其最終的特征質地和風味。蛋白質水解是由于內源酶的作用而導致的肌肉蛋白質降解，產生大量小分子肽類和游離氨基酸[1-2]，其中多肽的分子質量和分子結構介于氨基酸和蛋白質之間[3]。自由基是指含未成對電子的原子、原子團、分子或離子，具有較強的氧化活性，化學性質十分活潑[4-5]，機體內自由基積累過多時會引起DNA損傷，啟動蛋白質及脂質的過氧化反應，從而引起細胞損傷，導致疾病和衰老的發(fā)生[6-7]。多肽具有清除自由基、防止脂質過氧化等作用[3]。諾鄧火腿是云南著名特產之一[8-10]，其配料獨特、制作過程精細，具有質優(yōu)味美的特點。但云南省大理白族自治州云龍縣諾鄧村目前只有一家火腿廠生產諾鄧火腿，其他諾鄧火腿幾乎均來源于家庭小作坊式的自產自銷，產量極小[11-12]。目前，對不同加工年份諾鄧火腿粗肽的多肽特征及抗氧化活性差異的研究尚未見報道。本研究通過提取不同加工年份諾鄧火腿中的粗肽，測定其多肽含量、平均肽鏈長度（average peptide chain length，APCL）、多肽分子質量分布以及游離氨基酸組成，研究不同加工年份諾鄧火腿中多肽的特征差異，從而解釋不同發(fā)酵時間對蛋白質降解程度的影響。同時通過模擬脂質及蛋白質氧化體系研究不同加工年份諾鄧火腿粗肽的脂質及蛋白質氧化活性抑制能力的差異，為諾鄧火腿的深度開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

諾鄧火腿均由云南省大理白族自治州云龍縣諾鄧火腿食品廠提供。

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 天津市化學試劑廠；

鄰苯二甲醛 上海源葉生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 創(chuàng)亞化工（上海）有限公司；β-疏基乙醇 美國Sigma公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

H2-16KR冷凍離心機 湖南可成儀器設備有限公司；T25勻漿機 德國IKA公司；18N冷凍干燥機

寧波新芝生物科技有限公司；TU-1950紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 諾鄧火腿粗肽的提取

參考Zhu Chaozhi等[13]的方法，并稍作修改。取不同加工年份的諾鄧火腿股二頭肌部位肉樣，去除瘦肉中的肌腱及肌膜，切碎、斬勻后準確稱取30 g，加入100 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.2），冰浴勻漿3 次，在24 000 r/min條件下離心2 次，每次10 s，間隔1 s；取火腿勻漿液于4 ℃靜置2 h后，在4 ℃、10 000 r/min條件下冷凍離心10 min；取上清液，先用紗布過濾掉上浮的油脂，再加入3 倍體積的40%乙醇溶液，4 ℃條件下靜置12 h后，4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min；取上清液，冷凍干燥后即為粗肽粉，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 諾鄧火腿粗肽的特征分析

1.3.2.1 多肽含量測定

參考Church等[14]的方法，并稍作修改。

鄰苯二甲醛混合試劑的配制：稱取40 mg鄰苯二甲醛，溶于1 mL甲醇中，依次加入25 mL 0.1 mol/L的四硼酸鈉溶液、2.5 mL質量分數為20%的SDS溶液和100 μL

β-巰基乙醇，最后用去離子水定容至50 mL。為保證實驗數據的準確性，試劑現用現配。

取100 μL質量濃度為1 mg/mL的粗肽水溶液，與2.0 mL鄰苯二甲醛混合試劑混勻，室溫下孵育2 min，測定反應液在340 nm波長處的吸光度。用胰酪蛋白胨作為標準蛋白，配制質量濃度分別為0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008 mg/mL的梯度標準溶液，繪制標準曲線（線性方程為y=0.049 7x+2.078 8，R2=0.994 4），換算得到諾鄧火腿粗肽粉的多肽含量。

1.3.2.2 APCL測定

采用茚三酮顯色法測定多肽和氨基酸個數。參考嚴群芳[15]的方法，并稍作修改。

茚三酮顯色液的配制：將1 g茚三酮加入到25 mL沸水中，再加入1 g VC，攪拌15 min，冷卻，濾紙過濾，所得沉淀用清水洗滌3 次，干燥后即為還原茚三酮；將170 mg茚三酮和30 mg還原茚三酮溶于20 mL乙二醇甲醚中，得茚三酮顯色液。

向1 mL質量濃度為1 mg/mL的粗肽液中加入1 mL醋酸緩沖溶液和1 mL茚三酮顯色液，沸水浴15 min，冷卻后加入3 mL體積分數為60%的乙醇，在570 nm波長處測定吸光度。配制甘氨酸梯度標準溶液，在570 nm波長處測定其吸光度，繪制標準曲線，換算得到多肽含量，根據氨基酸的平均分子質量為126.7 D，計算得多肽個數。endprint

肽鏈長度是指組成多肽的氨基酸殘基數，一個多肽或氨基酸只有一個N端，采用茚三酮顯色法測定粗肽液的多肽個數。將多肽徹底酸解，根據上述操作測定氨基酸個數。APCL按照公式（1）計算。

（1）

1.3.2.3 分子質量分布情況測定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法[16-17]。

1.3.2.4 游離氨基酸組成測定

參照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》[18]。

1.3.3 諾鄧火腿粗肽的抗氧化活性分析

1.3.3.1 脂質氧化抑制能力測定

參照米蘭等[19]的方法，并稍作修改。亞油酸乳化液的配制：用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.2）將0.56 g亞油酸和0.056 g吐溫-20定容至100 mL。用去離子水配制質量濃度為25 mg/mL的諾鄧火腿粗肽液，并以相應質量濃度的谷胱甘肽（glutathion，GSH）溶液為對照組。取8 mL上述粗肽液和谷胱甘肽溶液，分別加入4 mL無水乙醇、10 mL亞油酸乳化液（0.02 mol/L，pH 7.0）和8 mL磷酸鹽緩沖液，將混合溶液密閉后置于暗處10 min。以去離子水代替粗肽液作為空白對照。

脂質氧化抑制率的測定：取0.1 mL上述反應后的混合溶液，依次加入4.7 mL體積分數為75%的乙醇溶液、0.1 mL質量濃度為30 mg/mL的硫氰酸銨溶液和0.1 mL 0.02 mol/L的FeCl2溶液，快速混勻，準確反應3 min后，在500 nm波長處測定吸光度。0時刻測得的吸光度計為A0，之后每隔24 h測定1 次吸光度，計為At，樣品的脂質氧化抑制能力以144 h時的氧化抑制率表示。脂質氧化抑制率按照公式（2）計算。

（2）

1.3.3.2 蛋白質氧化抑制能力測定

參照邢路娟等[20]的方法，并稍作修改。用磷酸鹽緩沖液配制質量濃度為25 mg/mL的牛血清蛋白標準溶液，取10 mL，加入5 mL質量濃度為20 mg/mL的2，2-偶氮二異丁基脒（2，2-azo two isobutyl amidine，AAPH）作為氧化劑，構建蛋白質氧化體系。向上述體系中分別加入10 mL質量濃度為25 mg/mL的諾鄧火腿粗肽液和GSH溶液（抗氧化劑），混合后在37 ℃條件下孵育24 h，加入5.0 mL質量濃度為0.02 mg/mL的二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）溶液終止反應。以不添加抗氧化劑作為陽性對照組。

羰基含量的測定：參照段麗菊等[21]的方法，并稍作修改。采用2，4-二硝基苯（2，4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）比色法：取1 mL上述反應液，在10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液200 μL，加入800 μL 10 mmol/L

的DNPH溶液（用2 mol/L HCl配制），暗處反應1 h，每10 min斡旋混勻1 次；反應結束后加入1 mL質量濃度為0.2 kg/L的三氯乙酸，反應10 min后在4 ℃、10 000 r/min

條件下離心10 min；用乙醇-乙酸乙酯溶液（1∶1，V/V）

洗滌沉淀3 次，最后用2.5 mL 6 mol/L的鹽酸胍溶解沉淀（37 ℃，水浴15 min），10 000 r/min條件下離心10 min，測定上清液在370 nm波長處的吸光度（A樣）。未添加AAPH的體系，采用上述相同方法測定吸光度（A空白）。

蛋白質含量的測定：向25 mg考馬斯亮藍中加入12.5 mL 95%乙醇，再加入30 mL磷酸緩沖液，定容至250 mL。配制牛血清蛋白梯度標準溶液，加入上述考馬斯亮藍溶液，繪制標準曲線。通過標準曲線計算樣品的蛋白質含量。

羰基含量按照公式（3）計算。

（3）

式中：a為比色皿直徑/cm；ρ為樣品的蛋白質質量濃度/（mg/mL）。

1.4 數據處理

樣品均重復測定5 次，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 19.0軟件對數據進行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）和Duncans多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同加工年份諾鄧火腿粗肽的多肽含量及APCL

由表1可知，諾鄧火腿粗肽的多肽含量隨著加工時間的延長呈現先上升后下降的趨勢，加工2 年諾鄧火腿粗肽的多肽含量最高，且與其他2 個加工年份的火腿存在顯著差異（P<0.05），這是由于火腿中的蛋白質在發(fā)酵過程中發(fā)生降解，使得多肽含量顯著增加[22-23]，而加工3 年的諾鄧火腿粗肽中多肽含量減少可能是因為發(fā)酵時間較長時，多肽降解為氨基酸[2]。諾鄧火腿粗肽是由不同肽鏈長度的多肽組成的混合物。由表2可知，不同加工年份諾鄧火腿粗肽的APCL及肽鏈平均分子質量均不存在顯著差異（P>0.05）。

2.2 不同加工年份諾鄧火腿粗肽的分子質量分布

1. 低分子質量標準蛋白，其分子質量在97.4～14.4 kD

之間；2～3. 加工1 年諾鄧火腿粗肽；4～5. 加工2 年諾鄧火腿粗肽；6～7. 加工3 年諾鄧火腿粗肽。

圖 1 不同加工年份諾鄧火腿粗肽的SDS-PAGE圖譜

Fig. 1 SDS-PAGE analysis of crude peptides extracted from Nuodeng hams of different agesendprint

由圖1可知，不同加工年份諾鄧火腿粗肽的電泳條帶在66.2 kD以下均有分布；加工3 年諾鄧火腿粗肽的電泳條帶中有6 條清晰可見，電泳條帶數量和粗肽的分子質量均小于其他2 個加工年份的火腿，這是由于發(fā)酵時間延長時，粗肽中更多的多肽被降解為了氨基酸；加工2 年諾鄧火腿粗肽的電泳條帶最多，清晰可見的條帶達數10 條。

2.3 不同加工年份諾鄧火腿粗肽的游離氨基酸組成

由表3可知，諾鄧火腿粗肽中含有大量的Glu、His、Leu、Ile、Pro、Ala等游離氨基酸，不同加工年份的諾鄧火腿粗肽中均含有Cys、His、Tyr和Ile等具有抗氧化性的氨基酸，其中Cys、His和Ile的含量在不同加工年份的火腿粗肽中差異不顯著（P>0.05）；加工1 年及2 年的諾鄧火腿粗肽中酸性氨基酸含量分別為（6.35±0.67）%和（6.76±0.30）%，堿性氨基酸含量分別為（4.82±0.30）%和（5.31±0.46）%，均與加工3 年的諾鄧火腿存在顯著差異（P<0.05）；加工2 年諾鄧火腿粗肽中疏水氨基酸和必需氨基酸含量分別為（8.45±1.31）%和（10.96±1.66）%，與加工3 年的諾鄧火腿均存在顯著差異（P<0.05）。

2.4 不同加工年份諾鄧火腿粗肽的脂質氧化抑制能力

由圖2可知，添加諾鄧火腿粗肽液和GSH溶液體系的脂質氧化抑制率均隨時間的延長一直增大，前72 h抑制率增加的速率較快，隨后增加趨勢趨于平穩(wěn)，說明諾鄧火腿粗肽液和GSH溶液對脂質氧化有一定的抑制作用；144 h時，加工1、2、3 年的諾鄧火腿粗肽液對脂質氧化的抑制率分別達77.95%、76.79%和75.45%，不同加工年份火腿間不存在顯著差異（P>0.05），但與GSH溶液的抑制效果（64.32%）存在極顯著差異（P<0.01），加工1、2、3 年諾鄧火腿粗肽液的脂質氧化抑制率比GSH溶液分別增加了13.63%、12.47%和11.13%，說明諾鄧火腿粗肽液的脂質氧化抑制效果優(yōu)于GSH溶液。這是由于在蛋白質的水解過程中，具有抗氧化活性的基團逐漸暴露出來，從而起到抗氧化作用。而諾鄧火腿粗肽液的脂質氧化抑制效果與加工年份存在不顯著差異可能與它們的APCL及平均分子質量有關。雖然加工1 年、2 年火腿中各類氨基酸的含量高于加工3 年的火腿，但其對脂質氧化過程的影響還與多肽的分子質量、氨基酸種類及序列有關，需要進一步深入研究。

2.5 不同加工年份諾鄧火腿粗肽的蛋白質氧化抑制能力

由圖3可知，用SDS-PAGE驗證諾鄧火腿粗肽蛋白質氧化抑制效果的實驗結果表明，添加諾鄧火腿粗肽及GSH的實驗組均具有一定的蛋白質氧化抑制能力，GSH的抑制能力明顯大于諾鄧火腿粗肽。蛋白質氧化會產生羰基，通過羰基含量能夠驗證蛋白質氧化抑制效果。由表4可知，未添加抗氧化劑時的羰基含量顯著高于添加諾鄧火腿粗肽（P<0.01），表明諾鄧火腿粗肽具有一定的蛋白質氧化抑制能力，且加工1 年和2 年的諾鄧火腿粗肽對蛋白質氧化的抑制效果明顯優(yōu)于加工3 年的火腿

（P<0.01）。這可能是由于加工1 年和2 年的諾鄧火腿粗肽中疏水氨基酸、酸性氨基酸和堿性氨基酸的含量高于加工3 年的火腿，分子質量分布也比加工3 年的火腿更廣，且加工2 年諾鄧火腿粗肽的多肽含量顯著高于加工3 年的火腿。

1. 未添加抗氧化劑組；2～4. 添加了加工1、2、3 年諾鄧火腿粗肽的實驗組；5. 添加了GSH的對照組；6.未添加氧化劑的空白組。

3 討 論

3.1 諾鄧火腿粗肽的提取及特征

提取火腿中抗氧化肽的常用方法是利用鹽酸或磷酸緩沖液提取。Escudero等[24-25]用0.01 mol/L的鹽酸溶液從西班牙火腿中提取出具有抗高血壓和抗氧化活性的短肽；邢陸娟等[20]用0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）提取宣威火腿中的粗肽，測得的多肽含量為60%。本研究利用磷酸鹽緩沖液提取不同加工年份諾鄧火腿中的多肽，提取出的粗肽是由不同分子質量的多肽組成的混合物，與茚三酮顯色劑呈顯色反應，說明多肽N端未被封閉，結構呈鏈狀[26]；加工3 年的諾鄧火腿粗肽中多肽含量最低，為67.20%，比加工1 年和2 年的火腿分別降低了1.15%和4.80%；加工3 年火腿粗肽的SDS-PAGE電泳條帶數目及分子質量均小于其他2 個加工年份的火腿，這可能是由于發(fā)酵時間較長時，火腿中的多肽被降解為

氨基酸[27]。胡亞亞等[28]用磷酸鹽緩沖液提取出的金華火腿粗肽的多肽含量為66.02%。

3.2 諾鄧火腿粗肽的抗氧化活性

多肽的抗氧化活性與其所含氨基酸種類有關。本研究結果表明，3 個加工年份的諾鄧火腿粗肽均表現出對于脂質和蛋白質的氧化抑制能力，其中加工1 年、2 年諾鄧火腿粗肽的抑制效果更好，這可能是由于二者的疏水氨基酸、酸性氨基酸及堿性氨基酸含量均高于加工3 年的火腿；加工2 年的火腿粗肽中疏水氨基酸、酸性氨基酸及堿性氨基酸的含量最高，但加工1 年火腿粗肽的脂質氧化抑制效果優(yōu)于加工2 年的火腿，這可能與其所含抗氧化肽的分子質量及氨基酸序列有關；抗氧化肽主要是分子質量小于6 000 D且含有少于20 個氨基酸殘基的分子[29]，火腿的多肽組成可以分為4 500～2 700 D、2 700～1 200 D、1 200～500 D、500～375 D和375～160 D這5 個分子質量范圍[30]。加工1 年、2 年和3 年諾鄧火腿粗肽的His含量分別為（1.48±0.22）%、（1.70±0.31）%和（1.51±0.14）%，但加工1 年的火腿粗肽比加工3 年的火腿粗肽有更好的脂質和蛋白質抑制效果，這可能是由于多肽的抗氧化性主要是由其分子質量、所含氨基酸種類和氨基酸序列三者共同決定的，這與徐力等[31]關于抗氧化肽的金屬離子親和力與His含量呈正相關的結果相符。endprint

4 結 論

通過提取不同加工年份諾鄧火腿中的粗肽，并對其特征進行分析，同時模擬脂質及蛋白質氧化體系，研究不同加工年份諾鄧火腿粗肽的脂質、蛋白質氧化抑制活性的差異。結果表明，不同加工年份的諾鄧火腿粗肽均具有抗氧化活性，加工2 年諾鄧火腿粗肽的多肽含量為72%，顯著高于其他2 個加工年份的火腿（P<0.05）；加工1 年、2 年和3 年諾鄧火腿粗肽的APCL及平均分子質量沒有顯著差異（P>0.05）；加工1 年、2 年火腿粗肽的各類游離氨基酸含量與加工3 年的火腿相比存在顯著差異（P<0.05）；諾鄧火腿粗肽液的脂質氧化抑制率高于GSH溶液，且差異極顯著（P<0.01），加工1 年和2 年諾鄧火腿粗肽的蛋白質氧化抑制效果優(yōu)于加工3 年的諾鄧火腿，且存在極顯著差異（P<0.01）。

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